微生物的生長量的測定方法課件

主講：李少鳳.一個微生物細胞合適的外界條件，吸收營養(yǎng)物質(zhì)，進行代謝。如果同化作用的速度超過了異化作用個體的生長原生質(zhì)的總量（重量、體積、大?。┚筒粩嘣黾尤绻骷毎M分是按恰當?shù)谋壤鲩L時，則達到一定程度后就會發(fā)生繁殖，引起個體數(shù)目的增加。群體內(nèi)各個個體的進一步生長群體的生長.群體生長=個體生長+個體繁殖個體生長→個體繁殖→群體生長微生物的生長量的測定方法很多，可以根據(jù)菌體細胞數(shù)量，菌體體積或質(zhì)量作直接測定，也可以用某種細胞物質(zhì)的含量或某個代謝活性的強度作間接測定。在微生物學中提到的“生長”，一般均指群體生長，這一點與研究大型生物時有所不同。.描述不同種類、不同生長狀態(tài)的微生物生長情況，需選用不同的測定指標。（一）微生物細胞數(shù)目的檢測法直接法（血球計數(shù)板）間接法（平板菌落計數(shù)法、液體稀釋法、濾膜過濾法、比濁法）（二）微生物生長量和生理指標測定法細胞干重法；總氮量測定法；其它生理指標測定法二、微生物純培養(yǎng)生長的測定方法.原理：將1cm2×0.1mm的薄層空間劃分為400小格，從中均勻分布地選取80或100小格，計數(shù)其中的細胞數(shù)目，換算成單位體積中的細胞數(shù)。適用范圍：個體較大細胞或顆粒，如血球、酵母菌等。不適用于細菌等個體較小的細胞，因為（1）細菌細胞太小，不易沉降；（2）在油鏡下看不清網(wǎng)格線，超出油鏡工作距離。特點：快速，準確，對酵母菌可同時測定出率，或在菌懸液中加入少量美藍可以區(qū)分死活細胞。（一）微生物細胞數(shù)目的檢測法1、血球計數(shù)板直接計數(shù)法.血球計數(shù)板是一塊特別的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴。中央有一短橫溝和兩個平臺，兩嵴的表面比兩個平臺的表面高0.1mm，每個平臺上刻有不同規(guī)格的格網(wǎng)，中央1mm2面積上刻有400個小方格(圖A)。蓋玻片計數(shù)室.在血球計數(shù)板上，刻有一些符號和數(shù)字(圖A)，其含義是：XB-K-25為計數(shù)板的型號和規(guī)格，表示此計數(shù)板分25大格；0.1mm為蓋上蓋玻片后計數(shù)室的高；1/400mm2表示將計數(shù)室面積1mm2分400個小格，每小格面積是1/400mm2。.血球計數(shù)板有兩種規(guī)格，一種是將1mm2面積分為25個大格，每大格再分為16個小格(25×16)；另一種是16個大格，每個大格再分為25個小格(16×25)。兩者都是總共有400個小格。當專用蓋玻片置于兩條嵴上，從兩個平臺側面加入菌液后，400個小方格(1mm2面積)計數(shù)室上形成0.1mm3的體積。通過對一定大格內(nèi)微生物數(shù)量的統(tǒng)計，可計算出1mL菌液所含的菌體數(shù)（圖B)。C兩種不同刻度的計數(shù)板.計數(shù)區(qū)的結構原液所含菌體數(shù)（mL）=每小格平均菌體數(shù)×400×104×稀釋倍數(shù).平板菌落計數(shù)法2.間接計數(shù)法將待測樣品進行適當稀釋，取一定的菌懸液涂布平板，讓微生物的單細胞一一分散在平板上，經(jīng)適宜條件培養(yǎng)，每個活細胞就會形成單菌落，然后將形成的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，就可推算出樣品的含菌數(shù)。.特點：簡單，靈敏，適用于細菌、酵母菌、芽孢與真菌孢子等數(shù)量的測定。不適合測定樣品中絲狀體微生物，如放線菌、絲狀真菌及絲狀藍細菌的營養(yǎng)體。樣品中的稀釋度控制在每個平板上菌落數(shù)在30～300個最好，過多難以計數(shù)，過少增大計數(shù)誤差。平板菌落計數(shù)法.★技術要求：樣品充分混勻，操作熟練快速（15～20min完成操作），嚴格無菌操作；★注意事項：每一支吸管只能用于一個稀釋度，樣品混勻處理，傾注平板時的培養(yǎng)基溫度；平板菌落計數(shù)法.液體稀釋法將待測樣品作一系列稀釋，一直稀釋到取少量該稀釋液(如1mL)接種到新鮮培養(yǎng)基中沒有出現(xiàn)生長繁殖為止。具體做法是取單細胞菌懸液在定量培養(yǎng)基中做系列稀釋培養(yǎng)，在一定稀釋度以前的培養(yǎng)基中接上菌，出現(xiàn)生長，而在這個稀釋度以后的培養(yǎng)液中沒有接上菌，不出現(xiàn)菌的生長，這最后一級出現(xiàn)菌生長的稀釋度稱為臨界級數(shù)，從3～5次重復的臨界級數(shù)求最大概率數(shù)(MPN)，就可得到較可靠的結果。2.間接計數(shù)法.例如：某一細菌在稀釋計數(shù)法中的生長情況如下：稀釋度10-310-410-510-610-710-8重復數(shù)555555出現(xiàn)生長的管數(shù)555410根據(jù)上述結果，其數(shù)量指標為“541”，查5次重復測數(shù)統(tǒng)計表，得近似值為17。乘以第一位數(shù)的稀釋倍數(shù)（105），則原液中的活菌數(shù)=17×100000=1.7×106

...薄膜過濾計數(shù)法常用該法測定含菌量較少的空氣和水中的微生物數(shù)目。將定量的樣品通過薄膜（硝化纖維素薄膜、醋酸纖維薄膜）過濾，菌體被阻留在濾膜上，取下濾膜進行培養(yǎng)，然后計算菌落數(shù)，可求出樣品中所含菌數(shù)。2.間接計數(shù)法....在科研及生產(chǎn)中，及時了解微生物的生長情況，測定培養(yǎng)物中微生物的數(shù)量，便于適時控制培養(yǎng)條件，獲得最佳培養(yǎng)物，比濁法是最常用的測定方法。是在濁度計或比色計上進行測定培養(yǎng)液中微生物的數(shù)量。某一波長的光線，通過渾濁的液體后，其光強度將被減弱。入射光一定范圍內(nèi)，菌懸液中的細胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌數(shù)越多，光密度越大。因此，借助于分光光度計，在一定波長下測定菌懸液的光密度，就可反應出菌液的濃度。特點：快速、簡便；但易受干擾。比濁法2.間接計數(shù)法.LogItIo—Kcd=It：透過光的強度；Io：入射光的強度；K：吸光系數(shù)；c：樣品液的濁度；d：液層厚度；透光度LogIt

Io稱消光系數(shù)，簡稱OD.當樣品液厚度一定，則OD值與樣品的濁度C有關，通過測定樣品的OD值來代表培養(yǎng)液中的濁度即微生物量。.本法測定的是微生物的總量。適用于非絲狀單細胞微生物，如細菌的測定。當待測菌液濃度太大時，要經(jīng)過適當稀釋。使OD值的讀數(shù)在一定范圍內(nèi)最好。比濁法.將一定量的菌液中的菌體通過離心或過濾的方法分離出來,用清水反復洗滌菌體，直接稱重，可得菌體濕重。再經(jīng)常壓或真空干燥，干燥溫度可在105℃、100℃或80℃下至恒重，精確稱重，即得微生物的干重。絲狀真菌用濾紙過濾，細菌用醋酸纖維膜等過濾。在瓊脂平板上培養(yǎng)的放線菌或絲狀真菌經(jīng)短時間高溫待瓊脂溶化后濾出菌絲，洗凈、烘干后測干重。該法適合于含菌量，而且樣品中不含非菌體的干物質(zhì)。1、細胞干重法（二）細胞生物量的測定.內(nèi)容：將青霉菌接種于適宜的液體培養(yǎng)基中。28℃震蕩培養(yǎng)5～7d，取定量濾紙一張，在分析天平上稱重a，取出青霉菌培養(yǎng)物放在濾紙上過濾，瀝干，然后置于80℃干燥箱中烘干至恒重b。菌體的干重=b-a儀器：分析天平、定量濾紙、電熱干燥箱菌種：青霉菌的振蕩培養(yǎng)物舉例：測定培養(yǎng)液中青霉菌的重量.2、總氮量測定法蛋白質(zhì)是細胞的主要物質(zhì)，含量穩(wěn)定，而氮是蛋白質(zhì)的主要成分，通過測含氮量就可推知微生物的濃度。一般細菌細胞干重的含氮量為12%～15%，酵母菌為7.5%，霉菌為6.5%，因此只要用化學法分析法（凱氏定氮法）測定出待測樣品的含氮量，就能推算出細胞的生物量。本法適用于在固體或液體培養(yǎng)條件下微生物總生物量的測定，但需充分洗滌菌體以除去含氮雜質(zhì)，操作程序較復雜，一般很少采用。.微生物細胞中的DNA含量不高(如大腸桿菌約占3%～4%)，比較穩(wěn)定，有人估算出每一個細菌細胞平均含DNA8.4×10-5ng，因而可以根據(jù)分離出樣品中的DNA含量來計算微生物的生物量。3、其他方法DNA含量測定法.測定單位體積培養(yǎng)物在單位時間內(nèi)消耗的營養(yǎng)物或O2的數(shù)量，或者測定微生物代謝過程中的產(chǎn)酸量或CO2量等，均可以在一定程度上反映微生物的生物量。本法系間接法，影響因素較多，誤差也較大，僅在特定條件下作比較分析時使用。代謝活性法.Table2.SomeMethodsusedtomeasurebacterialgrowthMethodApplicationCommentsDirectmicroscopiccountEnumerationofbacteriain

milkorcellularvaccinesCannotdistinguishlivingfromnonlivingcellsViablecellcount(colony

counts)Enumerationofbacteriainmilk,foods,soil,water,laboratorycultures,etc.VerysensitiveifplatingconditionsareoptimalTurbiditymeasurementEstimationsoflargenumbersofbacteriainclearliquidmediaandbrothsFastandnondestructive,butcannotdetectcelldensitieslessthan107cellspermlMeasurementoftotalNorproteinMeasurementoftotalcellyieldfromcultures

verydenseonlypracticalapplicationisintheresearchlaboratoryMeasurementofBiochemicalactivitye.g.O2uptakeCO2production,ATPproduction,etc.MicrobiologicalassaysRequiresafixedstandardtorelatechemicalactivitytocellmas