低分子量海帶巖藻聚糖硫酸酯的制備和其化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

低分子量海帶巖藻聚糖硫酸酯的制備和其化學(xué)結(jié)構(gòu)分析2023/7/81第1頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月研究背景海帶紅外光譜分析硫酸根含量相對(duì)分子質(zhì)量總糖第2頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月研究背景海帶活性抗凝血抗病毒增強(qiáng)免疫抗腫瘤抗血栓第3頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月研究現(xiàn)狀2對(duì)低分子量的巖藻聚糖硫酸酯的消化吸收、免疫活性和抗流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制作用的比較研究很少3加工的海帶中含有豐富的褐藻酸鈉、碘以及甘露醇，而加工隨之產(chǎn)生大量巖藻聚糖硫酸酯，往往都作為廢棄物丟棄，造成了很大的資源浪費(fèi)1目前低分子量的巖藻聚糖硫酸酯的制備和應(yīng)用的研究還相對(duì)較少，尤其是分子量對(duì)消化吸收及活性的比較研究鮮有報(bào)道第4頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月研究意義熟悉海帶巖藻聚糖硫酸酯的提取工藝1對(duì)提取的粗糖進(jìn)行化學(xué)分析2分離純化提取的粗糖，再對(duì)其做比較分析3巖藻聚糖硫酸酯氧化降解，為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備4第5頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月

巖藻聚糖硫酸酯分離純化、結(jié)構(gòu)分析用冷水浸提法從海帶中提取巖藻聚糖硫酸酯，為后面的分離純化做好準(zhǔn)備。對(duì)提出來的巖藻聚糖硫酸酯測(cè)定其總糖含量，單糖組成，硫酸根含量，紅外光譜分析，相對(duì)分子質(zhì)量和蛋白質(zhì)含量。

對(duì)分離純化后的巖藻聚糖硫酸酯測(cè)定其總糖含量，單糖組成，硫酸根含量，紅外光譜分析，相對(duì)分子質(zhì)量和蛋白質(zhì)含量。對(duì)其進(jìn)行自由基氧化降解，為安全、高效的抗血栓活性的巖藻聚糖硫酸酯的研究奠定基礎(chǔ)。海帶化學(xué)結(jié)構(gòu)分析研究內(nèi)容巖藻聚糖硫酸酯的制備大分子量的化學(xué)結(jié)構(gòu)分析氧化降解制備低分子量第6頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月1.海帶巖藻聚糖硫酸酯提取工藝第7頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)方法1235462.海帶化學(xué)結(jié)構(gòu)分析總糖含量——苯酚—硫酸法相對(duì)分子質(zhì)量——?jiǎng)P高效液相色譜法硫酸根含量——離子色譜法單糖組成——柱前衍生高效液相色譜法紅外光譜分析——Nicolet-Nexus470傅立葉變換紅外光譜儀蛋白質(zhì)含量——folin酚法第8頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月2.海帶巖藻聚糖硫酸酯的化學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.總糖含量

根據(jù)線性回歸方程測(cè)定所提取的海帶多糖總糖含量約為66.7%。

以巖藻糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用硫酸—苯酚法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算所提取的海帶多糖總糖含量。第9頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月2.海帶巖藻聚糖硫酸酯的化學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.相對(duì)分子質(zhì)量上圖為海帶巖藻聚糖硫酸酯的液相色譜圖，分子量分布較廣，范圍為5.4K-735K，重均分子量為698.7KDa，分布系數(shù)為4.24。選用Agillent1100高效液相色譜儀；色譜柱:TSK-gelG4000PWxl（7.8×30cm）；檢測(cè)器:示差檢測(cè)器（G1362ARID）；流動(dòng)相:0.2mol/LNaCl;流速:0.5mL/min；柱溫:0℃；

第10頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.硫酸根含量以為標(biāo)準(zhǔn)品，配制溶液，采用離子色譜法，制作硫酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)線性回歸方程及離子色譜譜圖分析計(jì)算得樣品中硫酸根含量。根據(jù)線性回歸方程及離子色譜譜圖分析計(jì)算得到樣品中硫酸根含量約13.27%。2.海帶巖藻聚糖硫酸酯的化學(xué)分析第11頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月2.海帶巖藻聚糖硫酸酯的化學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.單糖組成選用Agilent1100高效液相色譜儀，ZORBAXEclipse色譜柱XDB-C18分離柱（4.6×250mm，5μm）；245nm紫外檢測(cè)器(DAD)；流速為1.0mL/min；保持柱溫為25℃；流動(dòng)相A：10%(V/V)乙腈+0.1mol/L乙酸銨-乙酸緩沖液(pH5.5)；流動(dòng)相B：25%(V/V)乙腈+0.1mol/L乙酸銨-乙酸緩沖液(pH5.5)；時(shí)間梯度：0→40min，濃度梯度：40%→100%，流動(dòng)相B。每次的進(jìn)樣體積設(shè)定為10μL。樣品Man（%）GlcN（%）Rha（%）GalN（%）GlcUA（%）Glc（%）Gal（%）Xyl（%） Fuc（%）海帶硫酸多糖4.681.341.510.3222.582.1915.812.91 48.63第12頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)結(jié)果5.紅外光譜分析2.海帶巖藻聚糖硫酸酯的化學(xué)分析

由圖分析得：在3447左右有很強(qiáng)的糖的羥基(O-H)伸縮振動(dòng)吸收峰，2924左右有C-H的伸縮振動(dòng)吸收峰，1635處有C=O的伸縮振動(dòng)吸收峰，1411處有C=O的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，1259附近有較強(qiáng)的S=O的對(duì)稱吸收峰，819處的吸收峰是C—O—S伸縮振動(dòng)峰，它的位置與硫酸根在糖上的位置有關(guān)，表明硫酸根主要連接于糖的C2和C3位。第13頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)結(jié)果6.蛋白質(zhì)含量2.海帶巖藻聚糖硫酸酯的化學(xué)分析

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程計(jì)算出海帶多糖中蛋白質(zhì)含量約為15.28%±0.52%。以牛血清白蛋白BSA為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)方程計(jì)算海帶多糖中蛋白質(zhì)含量。第14頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)方法12343.海帶巖藻聚糖硫酸酯的分級(jí)純化及純化后的化學(xué)分析陰離子交換色譜分級(jí)純化總糖含量——苯酚—硫酸法硫酸根含量——離子色譜法法單糖組成——柱前衍生高效液相色譜法第15頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.巖藻聚糖硫酸酯的梯度洗脫3.海帶巖藻聚糖硫酸酯的分級(jí)純化及純化后的化學(xué)分析在巖藻聚糖硫酸酯的各級(jí)洗脫液中，由1.5mol/L氯化鈉溶液洗脫得到的組分含糖量最高。

將粗巖藻聚糖硫酸酯通過Q-SepharoseFF陰離子交換色譜（5.8*30cm），分別用0、0.5、1.0、1.5、2.0mol/LNaCl溶液分步洗脫，用硫酸－苯酚法檢測(cè)洗脫液的含糖量直到糖完全洗脫完畢。棄去H2O洗脫部分，分別收集其余組分。用截留分子量為1kDa的中空纖維超濾膜進(jìn)行超濾脫鹽，然后分別濃縮凍干，測(cè)定各組分的單糖組成、總糖含量和硫酸根含量。第16頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.總糖含量3.海帶巖藻聚糖硫酸酯的分級(jí)純化及純化后的化學(xué)分析Nacl濃度（mol/L）00.51.01.52.0總糖（%）61.4562.6364.5665.47 76.64第17頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.硫酸根含量3.海帶巖藻聚糖硫酸酯的分級(jí)純化及純化后的化學(xué)分析

巖藻聚糖硫酸酯各級(jí)洗脫組分Nacl濃度（mol/L）00.51.01.52.0硫酸根(%)8.54±0.576.77±0.469.98±0.8911.27±1.6518.41±1.95第18頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.不同分子量組分單糖組成的比較3.海帶巖藻聚糖硫酸酯的分級(jí)純化及純化后的化學(xué)分析Nacl濃度（mol/L）00.51.01.52.0Man1.01.423.813.011.2GlcN（D-(+)-1.93.11.80.7Rha3.63.84.22.01.7GalN（D-(+)-11.23.30.70.6GlcUA21.535.82.211.44.8Glc2.73.60.50.5Gal22.525.38.516.718.7Xyl2.62.25.01.23.2Fuc30.121.052.853.560.3第19頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月4.巖藻聚糖硫酸酯氧化降解檢測(cè)指標(biāo)14巖藻聚糖硫酸的氧化降解對(duì)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響分子量的測(cè)定一高效液相色譜法（HPLC）的影響對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響第20頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月4.巖藻聚糖硫酸酯氧化降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.巖藻聚糖硫酸的氧化降解采用2.5%過氧化氫降解高分子量巖藻聚糖硫酸酯，可以使巖藻聚糖硫酸酯的分子量迅速下降，分子量由原來的20萬左右，在1h、2h、3h的保留時(shí)間依次為18.233,14.136,13.639min，其重均分子量分別為42717Da、22484Da和10221Da。其硫酸根含量由24.80%上升到33.2%。第21頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月4.巖藻聚糖硫酸酯氧化降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果

低分子量巖藻聚糖硫酸酯的單糖組成分析組分fractionsFuc*(%)Gal*(%)Man*(%)Rha*(%)Glc*(%) Xyl*(%)GlcN*(%)GlcUA*(%)粗糖 48.6315.814.68 1.512.19 2.910.8022.58DF 60.25 21.74 6.56 2.21 1.24 2.8 1.2 5.4*所有單糖總和為100%。第22頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月4.巖藻聚糖硫酸酯氧化降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.低分子量巖藻聚糖硫酸酯紅外光譜采用Agilent1100高效液相色譜儀，選用TSK-gelG3000PWxl色譜柱（TosohBioscience）；用0.2mol/L的NaCl作為流動(dòng)相；洗脫速度為0.5mL/min；保持柱溫40℃，采用示差檢測(cè)器（G1362A）。第23頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月4.巖藻聚糖硫酸酯氧化降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果

第24頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月4.巖藻聚糖硫酸酯氧化降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果

比較紅外光譜分析圖4-1發(fā)現(xiàn)，中分子量巖藻聚糖硫酸酯組分F-1和F-2有共同的糖特征峰，在3447cm-1處有強(qiáng)吸收，為O-H伸縮振動(dòng)峰；2942cm-1為C-H伸縮振動(dòng)峰，