鼠疫檢測新技術(shù)新方法精選PPT

關(guān)于鼠疫檢測新技術(shù)新方法第1頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三一、核酸檢測技術(shù)（PCR檢測）二、標(biāo)記檢測技術(shù)（ELISA，膠體金）第2頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三一、核酸檢測技術(shù)定義：對動(dòng)植物、微生物的基因序列進(jìn)行測定。

核酸的分離與純化內(nèi)容：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù))

核酸雜交技術(shù)第3頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三核酸的純化與分離目的：獲得完整的核酸一級結(jié)構(gòu)，并提高核酸純度。

破碎細(xì)胞（細(xì)菌）

技術(shù)流程核酸提取

核酸純化第4頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三材料的前處理細(xì)胞破碎，核酸釋放核酸分離、純化沉淀或吸附核酸，去除雜質(zhì)核酸溶解緩沖液第5頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三全自動(dòng)核酸、蛋白提取儀第6頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR技術(shù)）

簡史：1971年，Khorana提出：DNA變性后，與合適引物進(jìn)行雜交，在DNA聚合酶作用下，延伸引物，并不斷重復(fù)該過程，即可克隆tRNA基因。1985年，Mullis等人發(fā)明聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），隨后，Mullis所屬公司PE推出第一臺PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀。第7頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三基本原理：第8頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三基本步驟第9頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三第10頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三實(shí)時(shí)定量PCR儀PCR儀第11頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三凝膠成像系統(tǒng)凝膠電泳系統(tǒng)第12頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三PCR結(jié)果判定（凝膠電泳）第13頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三PCR類型：

1.多重PCR

2.巢式PCR

3.定量PCR

4.反向PCR

5.逆轉(zhuǎn)錄PCR

第14頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三PCR技術(shù)在鼠疫檢測中的應(yīng)用鼠疫菌PCR檢測法：從疑似鼠疫的標(biāo)本（全血、組織）中檢測鼠疫菌，以鼠疫菌fra和pla基因片段作為PCR擴(kuò)增目的片段。鼠疫判定標(biāo)準(zhǔn)：PCR擴(kuò)增（fra+

pla）

+

膠體金抗原檢測or酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)or反相血凝試驗(yàn)=確診鼠疫第15頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三鼠疫菌核酸檢測樣本處理樣本類別1.鼠疫菌培養(yǎng)物2.鼠疫病人血液、痰液或尸檢標(biāo)本3.自斃或捕獲動(dòng)物血液或組織臟器（肝臟、脾臟等）4.媒介昆蟲第16頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三樣品處理方法1.煮沸法2.DNA提取試劑盒3.CTAB法4.氯仿抽提法第17頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三第18頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三鼠疫菌PCR檢測反應(yīng)體系10xbufferdNTPsFra-F（5’-GGAACCACTAGCACATCTGTT-3’）Fra-R（5’-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3’）Pla-F（5’-ACTACGACTGGATGAATGAAAATC-3’）Pla-R（5’-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3’）Taq聚合酶待檢測模板（基因組DNA）去離子水第19頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三鼠疫菌PCR檢測反應(yīng)程序預(yù)變性95℃5min1個(gè)循環(huán)變性95℃1min退火72℃1min延伸72℃1min變性72℃5min30個(gè)循環(huán)第20頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三M123456內(nèi)參基因PlaFra鼠疫PCR檢測電泳結(jié)果判定陽性結(jié)果：內(nèi)參基因+Pla+Fra陰性結(jié)果：內(nèi)參基因第21頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三核酸雜交技術(shù)

待檢測DNA或RNA先轉(zhuǎn)移并固定到硝酸纖維素或尼龍膜上，與其互補(bǔ)的單鏈DNA或RNA探針用放射性或非放射性標(biāo)記。在膜上雜交時(shí)，探針通過氫鍵與其互補(bǔ)的靶序列結(jié)合，洗去未結(jié)合的游離探針后，經(jīng)放射自顯影或顯色反應(yīng)檢測特異結(jié)合的探針。第22頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三二、標(biāo)記檢測技術(shù)標(biāo)記技術(shù)：用標(biāo)記物質(zhì)熒光素、同位素或酶等示蹤物質(zhì)標(biāo)記抗體（或抗原）進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)。通過測定標(biāo)記物-抗原-抗體復(fù)合物來定性或定量的檢測標(biāo)本中的抗體或抗原。第23頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三標(biāo)記檢測特點(diǎn)：標(biāo)記免疫技術(shù)=免疫技術(shù)+

標(biāo)記技術(shù)抗原抗體反應(yīng)示蹤物標(biāo)記靈敏性特異性標(biāo)記免疫技術(shù)的主要特點(diǎn)：高特異性、高靈敏性第24頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三鼠疫標(biāo)記檢測技術(shù)ELISA膠體金第25頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三ELISA技術(shù)原理：1.使抗原或抗體結(jié)合到到某種固相載體表面,并保持其免疫活性.2.在測定時(shí),把受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面抗原抗體反應(yīng).3.用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其它物質(zhì)分開,最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)量成一定比例.4.加入底物,通過顏色變化來測定.第26頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三ELISA的類型：間接法第27頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三雙抗夾心法第28頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三ELISA技術(shù)在鼠疫檢測中的應(yīng)用1.檢測鼠疫F1抗原（or抗體）原理：以雙抗體夾心法測定F1抗原為例。采用F1抗體包被反應(yīng)板，加入待測標(biāo)本，反應(yīng)除去未結(jié)合物質(zhì)，加入HRP-F1MCAb，如待測標(biāo)本中含有F1抗原時(shí)就與包被F1抗體、HRP-F1抗體結(jié)合形成復(fù)合物，加入OPD底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，反之就無顯色反應(yīng)。所需試劑及器材：HRP-F1McAb凍干劑，F(xiàn)1McAb包被板，鼠疫F1陽性對照、陰性對照，PBS（稀釋液）,顯色液（鄰苯二胺），終止液（2M硫酸）。ELISA檢測工作站，ELISA洗板機(jī)、振蕩器等第29頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三第30頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三第31頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三ELISA結(jié)果判讀：1.目測：平持反應(yīng)版，距白色背景5-10cm，從板的正上方觀察。（+++）深黃棕色；（++）淺黃棕色；（+）顏色明顯可見；（-）無色或顏色很淺2.ELISA檢測工作站

標(biāo)本OD/陰性O(shè)D>2.1位陽性。

第32頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三ELISA操作注意事項(xiàng)：（一）加樣

加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在Elisa板孔的底部，避免加在孔壁的上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。

加標(biāo)本一般用微量加樣器，每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸頭，以免交叉污染。（二）保溫

在Elisa中一般有二次抗原抗體反應(yīng)，此時(shí)反應(yīng)的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定的要求，保溫容器最好是水浴箱，可使溫度迅速平衡。

為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，或?qū)⑵桨逯糜跐窈兄小５?3頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三（三）洗滌

洗滌的目的是吸取反應(yīng)液中沒有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。洗滌一般采用以下方法：1、吸干孔內(nèi)反應(yīng)液。2、將洗滌液注滿孔板。3、放置3分鐘，略作搖動(dòng)。4、吸干孔內(nèi)液，也可傾去液體后在吸水紙上拍干，洗滌次數(shù)3-4次，又是需洗5-6次。（四）顯色和比色

顯色的最后一部是溫育反應(yīng)，此時(shí)酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物，反應(yīng)溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素，在定量測定中加入底物后的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確，而在定性測定中，可根據(jù)顯色程度適當(dāng)提高溫度，或者適當(dāng)縮短或延長反應(yīng)時(shí)間。第34頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三膠體金檢測技術(shù)：原理：將F1-McAb抗體以條帶狀固定在NC膜上，膠體金標(biāo)記F1-