氮饑餓誘導(dǎo)的兩種稻瘟菌分泌蛋白在等電點(diǎn)為4

氮饑餓誘導(dǎo)的兩種稻瘟菌分泌蛋白在等電點(diǎn)為4?7?5.9范圍內(nèi)的比較蔡翌陽云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明650201摘要稻瘟病菌是水稻生產(chǎn)上危害最大的病原真菌，病原菌的分泌蛋白在與寄主互作中起著重要的作用。由于會(huì)造成水稻的大量減產(chǎn)而備受關(guān)注，相關(guān)研究也較多。但其分泌蛋白在與水稻互作中的作用還不清楚。本文利用蛋白質(zhì)組學(xué)的雙向電泳技術(shù)對(duì)具有不同致病力的稻瘟病菌株在氮饑餓培養(yǎng)條件下的分泌蛋白進(jìn)行了初步分析，以探索不同致病力稻瘟病菌分泌蛋白的表達(dá)差異。關(guān)鍵詞：稻瘟病菌；分泌蛋白；雙向電泳；蛋白質(zhì)組學(xué)；1引言水稻(OryzasativaL)是最重要的糧食作物之一，在全球糧食生產(chǎn)和消費(fèi)中占有極其重要的地位，稻瘟病是世界水稻生產(chǎn)最主要的威脅因素之一⑴。稻瘟病是稻類作物中的三大病害之一，由子囊菌Magnaporthegrisea侵染而成。該病具有易暴發(fā)成災(zāi)的特點(diǎn)，國(guó)內(nèi)年發(fā)生面積平均在380萬hm2以上，流行年份一般可引起水稻減產(chǎn)10%?20%，高的則達(dá)到40%?50%,局部的可致顆粒無收⑵?，F(xiàn)代農(nóng)業(yè)日益依賴于品種大量單一化種植，使水稻的遺傳多樣性遭到破壞，進(jìn)一步加重了稻瘟病的流行和發(fā)展⑶。因此，通過對(duì)稻瘟病菌致病機(jī)制及其與水稻互作機(jī)制的研究以尋求新的防治水稻稻瘟病的方法或途徑，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐有著十分重要的意義。此外，稻瘟病菌作為一種典型的絲狀子囊菌，易于開展遺傳分析，在生長(zhǎng)發(fā)育和致病機(jī)制方面有諸多特點(diǎn)，也被作為研究絲狀真菌生長(zhǎng)發(fā)育和致病機(jī)制的重要模式生物⑷。1975年O'Farre首先提出雙向電泳的方法。雙向電泳作為蛋白質(zhì)組研究的三大核心技術(shù)之一，是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)中分離蛋白質(zhì)和肽的主要技術(shù)。雙向電泳技術(shù)分離蛋白質(zhì)的優(yōu)勢(shì)在于具有高分辨率、高重復(fù)性和高信息量，因此日益受到人們的廣泛關(guān)注。其原理是第一向根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pl)不同達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的即：第一向采用等電聚焦(IsoelectricFocusing,IEF)進(jìn)行第一次分離，第二向根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量不同達(dá)到分離的目的即：第二向沿垂直方向用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SodiumDodecylSulfatePolyacrylamideGelElectrophoresis,SDS)進(jìn)行第二次分離。分泌蛋白質(zhì)組(Secretome)通常是指生物體在某種條件下分泌到細(xì)胞外的所有蛋白的集合，是蛋白質(zhì)組內(nèi)研究的一個(gè)重要分支。由于分泌蛋白在植物病理學(xué)研究中的重要地位，植物病原菌的分泌蛋白質(zhì)組學(xué)研究已逐漸成為分子植物病理學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。目前對(duì)于稻瘟病菌的分泌蛋白質(zhì)組的文獻(xiàn)比較少，對(duì)其組成、結(jié)構(gòu)和功能還不清楚。已有實(shí)驗(yàn)表明，氮脅迫可能是植物致病菌在植物體內(nèi)遇到的主要環(huán)境脅迫之一⑸。Talbot等證明了氮饑餓狀態(tài)是誘導(dǎo)稻瘟病菌侵染水稻后水稻形成病狀的誘因之一，有利于附著胞的形成，并增強(qiáng)該菌侵染性⑹。此外，有許多研究表明在氮饑餓壓力下稻瘟菌可以被誘導(dǎo)產(chǎn)生大量與致病相關(guān)的分泌蛋白，因此氮饑餓壓力被認(rèn)為是稻瘟菌侵染寄主過程中產(chǎn)生病害癥狀的誘導(dǎo)條件之一⑺。從全基因組水平分析稻瘟菌在氮饑餓壓力下的基因表達(dá)情況表明，將稻瘟病菌轉(zhuǎn)移到缺乏氮源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)12和48h后，共同表達(dá)520個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平得到提高，并且其中36個(gè)已被證明是稻瘟病菌的致病基因⑻。因此，可以利用稻瘟病菌在氮饑餓培養(yǎng)條件下的分泌到培養(yǎng)基中的分泌蛋白作為其致病相關(guān)蛋白研究的材料。隨著稻瘟病菌全基因組測(cè)序的完成⑼，使得從全基因組水平分析和研究該菌某一類型基因功能成為可能。因此，利用生物信息學(xué)的方法，分析稻瘟病菌全基因組所編碼的所有分泌蛋白，在此基礎(chǔ)上，對(duì)氮饑餓條件下的不同致病力稻瘟病菌的分泌蛋白進(jìn)行雙向電泳，采用生物信息學(xué)的方法對(duì)獲得序列的分泌蛋白進(jìn)行比較分析，預(yù)測(cè)與致病性有關(guān)的蛋白，從而能夠更深地了解稻瘟病菌的分泌蛋白質(zhì)組的組成和功能。本次研究的目的首先建立一種較適合進(jìn)行稻瘟病菌分泌蛋白樣品雙向電泳的實(shí)驗(yàn)技術(shù)體系，并對(duì)該實(shí)驗(yàn)技術(shù)體系進(jìn)行進(jìn)一步的完善。其次是比較分析弱毒性稻瘟菌菌株Y98-16t與強(qiáng)毒性稻瘟菌菌株Y99-63C在氮饑餓壓力下被誘導(dǎo)表達(dá)的分泌蛋白(等電點(diǎn)在4.7-5.9范圍內(nèi))的差異性。

2.材料與方法2.1主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備用于本實(shí)驗(yàn)研究的主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備（見表2.1）。表2.1主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備Table2?1Mainexperimentalequipments儀器產(chǎn)家L7—65超速離心機(jī)Beckman-80°C超低溫冰箱THEROMOELECTRONCorporationAMBZ-5-P型實(shí)驗(yàn)室級(jí)專用超純水機(jī)AMERICANTN-1008型托盤天平上海精科天平LA120S-0CE分析天平SartoriusTHZ-82A臺(tái)式恒溫振蕩器上海醫(yī)療器械廠TS-1型脫色搖床江蘇醫(yī)用儀器廠BIO-RADPROTEANIEFCell聚焦儀BIO-RADBIO-RADPROTEANRIIXiCell電泳槽BIO-RADBIO-RADPOWERPAC300電源BIO-RAD凝膠掃描儀MicrotekPDQuest7.40分析軟件BIO-RAD冷凝水循環(huán)儀Thermo蛋白核酸分析儀AmershamBioscience2.2實(shí)驗(yàn)試劑及主要配方pH4.7-5.9線性17cmIPG預(yù)制膠條，礦物油，封膠液，十二烷基磺酸鈉，丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，Tris堿，甘氨酸，3-［（3-膽酰胺丙基）-二乙胺］-丙磺酸，磺基三甲基胺乙內(nèi)脂3-10，兩性電解質(zhì)，均購(gòu)自美國(guó)Bio-RAD公司；尿素（Urea）、丙稀酰胺（Acrylamide）、甲叉雙丙烯（Bisacrylamide）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸鈉（EDTAN^）均購(gòu)自Bebco公司，硫脲（Thiourea）購(gòu)自AMRESCO公司，苯甲基磺酰氟（PMSF）、二硫蘇糖醇（DTT）、N,N,N'N-四甲基乙二胺（TEMED））3-（Decyldimethylammonio）Propanesulfonateinnersalt（SB3—10）、碘乙酰胺（IAA）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、甘油（Glycerol）、過硫酸銨（Ap）均購(gòu)自Sigma公司標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量來自于Fermentas公司#SM0431型的蛋白分子量Marker。無水碳酸鈉、七水硫酸鎂、醋酸鈉、磷酸二氫鉀等其它常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。本研究中所用的主要培樣基配方如下：葡萄糖酵母粉培養(yǎng)基配方：2.5g葡萄糖，0.5g酵母粉，2.0g瓊脂，用去離子水定容到100ml。液體完全培養(yǎng)基配方：6.00gNaNO3，0.52gKCl，0.52gMgSOfH2O,1.52gKH2PO4，10.00g葡萄糖，2.00g蛋白胨，1.00g酵母粉，1.00g酪蛋白氨基酸，2.00ml微量元素，用去離子水定容1000ml。微量元素配方：2.20gZnSO4?7H2O,1.10gH3BO3，0.50gMnC'4H2O,0.50gFeSO4.7H2O,0.16gCoCl”H2O,0.16gCuSO『5H2O,0.11g（NH4）6Mo7O24-4H2O，5.00gNa2?EDTA，去離子水定容到100ml。氮饑餓培養(yǎng)基中配方：0.52gKCl,0.52gMgSO4.7H2O,1.52gKH2PO4,10.00g葡萄糖，2.00ml微量元素，去離子水定容到1000ml蒸餾水。2.3稻瘟病菌株及培養(yǎng)方法用于本實(shí)驗(yàn)研究的稻瘟病菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存的且經(jīng)過致病力鑒定具有強(qiáng)制病力的稻瘟病菌株Y99-63C以及弱致病力的稻瘟病菌株Y98-16t。將用濾紙片保存的稻瘟病菌株轉(zhuǎn)接到葡萄糖酵母粉培養(yǎng)基的培養(yǎng)基上，放于28°C培養(yǎng)箱活化菌株。10天后待形成較大的菌落后，根據(jù)Talbot等的方法用接種針挑取3塊大小一致（約0.5cm2）的菌塊到250mL的液體完全培養(yǎng)基中，于28°C、120rpm搖床培養(yǎng)5d,在超凈工作臺(tái)上，用2層滅菌紗布過濾，并用滅菌雙蒸水沖洗菌絲多次，直至洗出液無色。將沖洗好的菌絲轉(zhuǎn)移到250ml氮饑餓培養(yǎng)基中，并放于28°C、120rpm搖床下氮饑餓培養(yǎng)48h,分別用無菌濾紙和0.22微米的濾膜過濾除去菌絲，并收集濾液。2.4蛋白樣品制備本實(shí)驗(yàn)采用TCA-DOC沉淀法從氮饑餓處理稻瘟病菌48h后的培養(yǎng)基中提取稻瘟病菌分泌蛋白：（1）用0.02%的DOC（Nadeoxycholate，脫氧膽酸鈉）處理過濾后的液體培養(yǎng)基，冰上靜置30min；（2）用100%的TCA（Trichloroaceticacid.,三氯乙酸）處理，使TCA最終濃度達(dá)到10%，冰上靜置2個(gè)小時(shí)；（3）于15,000xg,4°C下離心30min,移去上清液，用置于一20「C冰箱中冰冷的100%的丙酮徹底清洗沉淀一次后，再用置于一20oC冰箱中的80%的丙酮清洗2-3次;（4）用少量水化上樣緩沖液懸浮沉淀，放于-80C冰箱中備用。2.5Bradford法測(cè)量蛋白含量蛋白濃度的測(cè)定參考的是Bradford法［11］，具體步驟如下：1、取8支10mL試管，7支用于測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白（牛血清蛋白）樣品的吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，1支用于測(cè)量待測(cè)蛋白樣品。在7只試管中分別加入1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白（牛血清蛋白）溶液：0mL、0.01mL、0.02mL、0.04mL、0.06mL、0.08mL和0.1mL,然后用去離子水補(bǔ)充到0.1mL。最后各試管中分別加入3.5mL考馬斯亮蘭G-250染色液并充分混勻。表2.5G-250染色液配方Table2?5IngredientsoftheCoomassieBrilliantBlueG250stainingsolution試劑名稱濃度(g/L,v/v)ReagentConcentration(g/L,v/v)考馬斯亮藍(lán)G-2500.1095%乙醇5%85%磷酸12%2、 加完試劑2至5分鐘后，用比色皿在分光光度計(jì)上測(cè)定各樣品在595nm處的光吸收值A(chǔ)595，空白對(duì)照為第1號(hào)試管，即0.1mL去離子水中加3.5mLG-250染色液。3、 標(biāo)準(zhǔn)蛋白的質(zhì)量（mg）為橫座標(biāo)，吸光度值A(chǔ)595為縱座標(biāo)作圖，做標(biāo)準(zhǔn)曲線從而獲得線性回歸方程。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測(cè)樣品595nm處的吸光度值代入方程，即可算出待測(cè)蛋白樣品的蛋白含量。2.6雙向電泳實(shí)驗(yàn)步驟2.6.1水化1、 用去離子水仔細(xì)洗凈水化盤并置于干凈環(huán)境下晾干；2、 根據(jù)每個(gè)樣品蛋白含量加入適量水化上樣緩沖液，放置在室溫中解凍；表2?6水化上樣緩沖液配方Table2?6Ingredientsoftherehydrationbuffer試劑名稱Reagent濃度(g/L)Concentration(g/L)尿素300硫脲1523-［（3-膽酰胺丙基）-二乙胺］-丙磺酸20磺基三甲基胺乙內(nèi)脂3-10200二硫蘇糖醇（現(xiàn)加）100兩性電解質(zhì)5溴酚藍(lán)0.013、 從-80°C的冰箱中取出蛋白樣品，每個(gè)蛋白樣品（含有200^g蛋白樣品）用已解凍的水化上樣緩沖液定容到最終體積為450pL，每個(gè)蛋白樣品稱量0.02gDTT；4、 充分振蕩使DTT充分溶解；5、 加入2yLBio-lyte（pH3.0-pH10.0）；6、 室溫下靜置30min,20min時(shí)從-20°C的冰箱中取出IPG膠條，室溫下解凍10min；7、 將蛋白樣品緩慢均勻地加入水化槽，并且做好標(biāo)記。8、 去掉IPG膠條表面的保護(hù)膜，用鑷子夾住膠條的一端，輕輕放入水化槽，使膠條與水化液均勻接觸。9、 等待20min左右，膠條充分吸收水化液后，用3至5ml礦物油均勻滴加與水化槽內(nèi)，用封口膜將水化盤的四邊仔細(xì)封好，在室溫下放在水平的桌面上進(jìn)行被動(dòng)水化13-15h。2.6.2第一向等電聚焦（IEF）1、 用去離子水仔細(xì)洗凈聚焦盤并晾干；2、 將聚焦盤放入等電聚焦儀中，對(duì)準(zhǔn)正，負(fù)極；3、 取兩片鹽橋，分別放在正，負(fù)電極絲上，并各加8yL去離子水；4、 從水化盤中取出已經(jīng)水化完成的膠條，并用濾紙輕輕吸干膠條表面殘余的礦物油及蛋白樣品；5、 對(duì)準(zhǔn)正，負(fù)極后將膠條的膠面朝下輕輕地放入聚焦盤；

6、 加入2-3mL礦物油；7、 用鑷子輕輕壓出膠條下面的空氣；8、 輕輕蓋上聚焦盤的蓋子；9、 針對(duì)樣品設(shè)置適當(dāng)?shù)木劢钩绦?聚焦程序見表261)表2.6.聚焦程序Table2.6.1Thetheprogramforisoelectrofocusing程序編號(hào)電壓(V)升壓方式時(shí)間(h)ProgramNo.Voltage(V)ModeTime(h)S150慢速0.5S2250慢速1.0S3500快速1.5S41000快速2.0S54000線性3.0S69000線性3.0S79000線性50000V.hS8500快速3.52.6.3膠條平衡及第二向1、 用去離子水仔細(xì)洗凈水化盤，玻璃板并晾干；2、 配制12%SDS凝膠，注意確保膠面水平。

表2.6.212%SDS凝膠配方Table2?6?2Ingredientsofthe12%SDS試劑名稱Reagent濃度(v/v)Concentration(v/v)去離子水33%30%聚丙烯酰胺40%1.5M三羥甲基氨基甲烷25%(pH8.8)10%十二烷基磺酸鈉1%10%過硫酸銨（現(xiàn)配）1%四甲基乙二胺0.04%3、 從-20°C冰箱中取出平衡母液，室溫下解凍；4、 稱0.05gDTT加入平衡母液（2.5mL/管）（平衡液I）。表2.6.3平衡母液配方Table2?6?3Ingredientsoftheequilibrationbuffer試劑名稱濃度(g/L,v/v)ReagentConcentration(g/L,v/v)尿素360十二烷基磺酸鈉201.5M三羥甲基氨基甲烷（pH8.8）25%甘油20%5、 從聚焦盤中取出膠條，并用濕濾紙輕輕吸干膠條表面殘余的礦物油;6、 將平衡液I倒入水化盤，放入膠條（膠面朝上）；7、 在搖床上振蕩15min，50rpm；8、 稱0.0625gIAA加入平衡母液（2.5mL/管）（平衡液II）；9、 組裝電泳槽；10、 取出膠條，在干濾紙上滴干；11、 將平衡液II倒入水化盤，放入膠條（膠面朝上）；12、 在搖床上振蕩15min，50rpm；

13、 在微波爐中溶化封膠液;14、 配電泳緩沖液。表2.6.4電泳緩沖液配方Table2?6?4Ingredientsoftheelectrophoresisbuffer試劑名稱Reagent濃度(g/L)Concentration(g/L)三羥甲基氨基甲烷3.00甘氨酸14.40十二烷基磺酸鈉1.0015、 在電泳槽的外槽中加入電泳緩沖液;16、 加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液。表2.6.5低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液配方Table2?6.5Ingredientsoftheoverlayagarose試劑名稱 濃度(g/L)Reagent Concentration(g/L)低熔點(diǎn)瓊脂糖 5.00三羥甲基氨基甲烷3.00甘氨酸14.40十二烷基磺酸鈉1.00溴酚藍(lán)0.0317、 將膠條在電泳緩沖液中浸泡一下；18、 用鑷子輕輕將膠條壓入封膠液，使其與膠面盡可能的緊密接觸;19、 等待約5min,至圭寸膠液冷凝；20、 在電泳槽的內(nèi)槽中加入電泳緩沖液；21、 設(shè)置適當(dāng)?shù)腟DS電泳程序表2.6.6SDS電泳程序Table2?6?6ProgramoftheSDS電壓(V)Voltage(V)時(shí)間(h)Time(h)700.530052.7蛋白銀染本實(shí)驗(yàn)所采用的蛋白銀染方法適合質(zhì)譜測(cè)序［11，分為9步：固定，敏化,水洗，銀染，水洗，顯影，終止，水洗，凝膠掃描與保存。1、固定在TS-1型脫色搖床(40rpm)上用固定液固定2h或者過夜。表2.7.1固定液配方Table2?7?1Ingredientsofthefixingsolution試劑名稱濃度(v/v)ReagentConcentration(v/v)甲醇40%冰乙酸10%2、敏化在TS-1型脫色搖床(40rpm)用敏化液敏化30min。表2.7.2敏化液配方Table2?7?2Ingredientsofthesensitizingsolution試劑名稱Reagent濃度(g/L,v/v)Concentration(g/L,v/v)無水乙醇30%無水硫代硫酸鈉4.00無水醋酸鈉68.00g3、 水洗在TS-1型脫色搖床（40rpm）用去離子水水洗3次，每次5min。4、 銀染在TS-1型脫色搖床（40rpm）用銀染液避光銀染20min。表2.7.3銀染液配方Table2?7?3Ingredientsofthesilverstainingsolution試劑名稱濃度(g/L)ReagentConcentration