實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)原理應(yīng)用及實(shí)踐

實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)原理應(yīng)用及實(shí)踐第1頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月2北京康為世紀(jì)生物科技有限公司康為的目標(biāo)：成為中國的Invitrogen您的問題解決專家！第2頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月3北京康為世紀(jì)生物科技有限公司

分子生物學(xué)核酸提取PCR、RT-PCR及熒光定量PCRDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)克隆與轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)學(xué)相關(guān)蛋白提取與純化蛋白定量、蛋白Marker及蛋白電泳產(chǎn)品WesternBlot產(chǎn)品

免疫學(xué)相關(guān)免疫組化產(chǎn)品、免疫沉淀標(biāo)簽抗體內(nèi)參抗體二抗完善的產(chǎn)品線第3頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月4五大平臺(tái)一站式服務(wù)第4頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月5園區(qū)公共服務(wù)平臺(tái)2010年康為世紀(jì)公司依托江蘇省泰州市政府及中國醫(yī)藥城的支持政策，成立江蘇康為世紀(jì)，主要進(jìn)行創(chuàng)新的臨床診斷試劑的研發(fā)、生產(chǎn)與相應(yīng)的技術(shù)服務(wù)，占地面積約3300平米2700平米的實(shí)驗(yàn)區(qū):

臨床生化診斷試劑研發(fā)平臺(tái)免疫診斷試劑研發(fā)平臺(tái)分子診斷試劑研發(fā)平臺(tái)免疫組化診斷試劑研發(fā)平臺(tái)約300平米GMP標(biāo)準(zhǔn)的生產(chǎn)車間總投資6500萬元泰州國家生物產(chǎn)業(yè)基地臨床診斷試劑研發(fā)與生產(chǎn)公共服務(wù)平臺(tái)第5頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月6熒光定量PCR儀芯片點(diǎn)樣儀芯片掃描儀全自動(dòng)核酸提取儀超速離心機(jī)焦磷酸DNA測(cè)序儀分子生物學(xué)平臺(tái)凝膠成像儀泰州國家生物產(chǎn)業(yè)基地臨床診斷試劑研發(fā)與生產(chǎn)公共服務(wù)平臺(tái)芯片雜交儀第6頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月康為世紀(jì)生物科技有限公司7完善的產(chǎn)品線分子生物學(xué)全系列產(chǎn)品蛋白質(zhì)學(xué)產(chǎn)品免疫學(xué)相關(guān)產(chǎn)品一站式服務(wù)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)平臺(tái)分子生物學(xué)平臺(tái)蛋白表達(dá)與純化平臺(tái)抗體制備純化平臺(tái)免疫學(xué)檢測(cè)平臺(tái)北京康為世紀(jì)生物科技有限公司我們的客戶我們的合作伙伴北京大學(xué)、清華大學(xué)、復(fù)旦大學(xué)等中國科學(xué)院協(xié)和醫(yī)院、上海瑞金、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院301醫(yī)院、醫(yī)院華大基因、諾華制藥九強(qiáng)、博奧等第7頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月

用我們的產(chǎn)品發(fā)表的部分SCI文章a-Bisabololinducesdose-andtime-dependentapoptosisinHepG2cellsviaaFas-andmitochondrial-relatedpathway,involvesp53andNFkBStateKeyLaboratoryofVirology,CollegeofLifeSciences,WuhanUniversity,Wuhan430072,ChinaCCR4-NOTDeadenylatesmRNAAssociatedwithRNA-InducedSilencingComplexesinHumanCellsStateKeyLaboratoryofMolecularBiologyandCellBiology,ShanghaiInstitutesforBiologicalSciences,ChineseAcademyofSciences,Shanghai,ChinaCoadministrationofhuperzineAandligustrazinephosphateeffectivelyreversesscopolamine-inducedamnesiainratsSchoolofPharmacy,EastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai200237,PRChinaEffectsofMicrogravityModeledbyLargeGradientHighMagneticFieldontheOsteogenicInitiationofHumanMesenchymalStemCellsCCR4-NOTdeadenylatesRISC-associatedmRNAinhumancells

StateKeyLaboratoryofMolecularBiology,InstituteofBiochemistryandCellBiologyShanghaiInstitutesforBiologicalSciences,ChineseAcademyofScienceshanghai,china第8頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月主要內(nèi)容

Real-timeqPCR的定量原理2Real-timeqPCR的檢測(cè)方法3Real-timeqPCR的基本概念1Real-timeqPCR的解析方法4第9頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR：偉大的天才發(fā)明UseofLSDSynthesisandself-testingofnovelpsychoactivesubstancesBeliefinastrology第10頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR：基本原理Denaturation:94–96°CAnnealing:50–65°CExtension:70–75°C基本要素：

TemplatePrimersDNApolymerasedNTP,N=A,G,CorT第11頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月

PCR：基本原理理想的PCR反應(yīng)：

N=N0*2n實(shí)際的PCR反應(yīng)：

N=N0*(1+E)nN0：初始模板量N：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)

E：擴(kuò)增效率S形曲線，具有平臺(tái)效應(yīng)第12頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月

與普通PCR的對(duì)比同一個(gè)樣本進(jìn)行96次重復(fù)傳統(tǒng)PCR檢測(cè)RealtimePCR檢測(cè)RealtimePCR--起點(diǎn)檢測(cè)：--起點(diǎn)量是樣本中起始的DNA量--“加入了500個(gè)拷貝”--具有重現(xiàn)性，誤差小傳統(tǒng)PCR--終點(diǎn)檢測(cè)：--終點(diǎn)產(chǎn)物量經(jīng)過PCR放大的DNA量--“生成了500，0000，0000個(gè)拷貝”--不恒定，誤差大傳統(tǒng)PCR檢測(cè)第13頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月Real-timeqPCR激發(fā)光發(fā)射光--在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)。--熒光基團(tuán)在激發(fā)光的作用下，產(chǎn)生波長更長的發(fā)射光。--利用熒光信號(hào)的變化動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)整個(gè)反應(yīng)過程。

熒光基團(tuán)第14頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月

擴(kuò)增曲線（primarycurve）擴(kuò)增曲線：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物不斷累積，熒光信號(hào)強(qiáng)度不斷增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一次熒光信號(hào)，通過熒光強(qiáng)度的變化監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，從而得到擴(kuò)增曲線圖?？v坐標(biāo)：Rn（熒光值）橫坐標(biāo)：cyclenumber（循環(huán)數(shù)）線性圖對(duì)數(shù)圖第15頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月

熒光閾值（threshold）基線(baseline)：一般以PCR反應(yīng)前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為本底信號(hào)熒光閥值(threshold)：擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值--缺省設(shè)置：PCR反應(yīng)前3-15個(gè)循環(huán)熒光本底信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍--手動(dòng)設(shè)置：大于樣本的熒光背景值第16頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月Ct

值(CycleThreshold)Ct值：PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)，熒光值所對(duì)應(yīng)的PCR循環(huán)次數(shù)。起始模板量基線閾值Ct值第17頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月

Ct

值(CycleThreshold)Ct值的特點(diǎn)：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，平臺(tái)期DNA拷貝數(shù)波動(dòng)很大，但Ct值相對(duì)固定；Ct值則極具重現(xiàn)性第18頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月Ct值可以確定初始模板量？

Rn=RB+X0

(1+E)N*RS第n個(gè)循環(huán)的總信號(hào)=本底信號(hào)+起始DNA數(shù)目*PCR擴(kuò)增效率*單位信號(hào)強(qiáng)度當(dāng)循環(huán)次數(shù)n=Ct時(shí)RCt=RB+X0

(1+E)Ct*RS兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得:lg(RCt-RB)=lgX0+Ctlg(1+E)+lgRSCt=-lgX0/lg(1+E)+lg(RCt-RB)-lgRS/lg(1+E)

Ct=-klgX0+bCompanynamelgX0與Ct值呈線性關(guān)系根據(jù)Ct值可以計(jì)算出樣本中起始模板所含有的拷貝數(shù)起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。第19頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月CompanynameRnvs.Cyclenumber--擴(kuò)增曲線LogDNAvs.Ct--標(biāo)準(zhǔn)曲線.未知10410310610510210標(biāo)準(zhǔn)曲線(standardcurve)標(biāo)準(zhǔn)曲線分析--對(duì)已知或未知樣本進(jìn)行系列濃度梯度稀釋第20頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月y=-ax+b測(cè)定熒光定量PCR反應(yīng)的有效性--線性的標(biāo)準(zhǔn)曲線：相關(guān)系數(shù)R2--擴(kuò)增效率：擴(kuò)增效率(E)=10-1/斜率-1標(biāo)準(zhǔn)曲線分析第21頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月

熒光定量PCR檢測(cè)方法染料標(biāo)記：

SYBRGreenI探針標(biāo)記：水解探針：

TaqMan非水解探針：Molecularbeacon

第22頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月SYBRGreenI工作原理SYBRGreenI

是一種與雙鏈DNA小溝結(jié)合的熒光染料。SYBRGreenI只與雙鏈DNA結(jié)合才能發(fā)出熒光。熒光信號(hào)與雙鏈DNA分子數(shù)成正比，隨著擴(kuò)增產(chǎn)物增加而增加。熒光信號(hào)強(qiáng)度與反應(yīng)體系中所有雙鏈DNA分子成正比。第23頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月5’3’5’3’SGSGSGSG5’3’5’3’SGSGSGSGEmissionExcitation--變性時(shí)，DNA雙鏈分開，無熒光信號(hào)。--延伸結(jié)束時(shí)，采集熒光信號(hào)。SYBRGreenI工作原理第24頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月SYBRGreenI優(yōu)點(diǎn)：

使用方便，成本低--僅需設(shè)計(jì)兩個(gè)引物通用性好--對(duì)DNA模板沒有選擇性需要在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，對(duì)產(chǎn)物做融解曲線分析。缺點(diǎn)：SYBRGreen與所有雙鏈DNA結(jié)合--引物二聚體或錯(cuò)誤擴(kuò)增產(chǎn)物造成假陽性--只能檢測(cè)單一模板，無法進(jìn)行多重檢測(cè)第25頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月將溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)。(-dI/dT)

融解曲線(dissociationcurve)確認(rèn)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性對(duì)數(shù)圖譜原始圖譜第26頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月融解曲線分析--非特異性產(chǎn)物--引物二聚體第27頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月

Taqman

工作原理探針與靶序列配對(duì)（一段序列，兩個(gè)基團(tuán)，5’

報(bào)告基團(tuán)、3’淬滅基團(tuán)）完整的探針，報(bào)告基團(tuán)R發(fā)射的熒光被淬滅基團(tuán)Q淬滅，沒有熒光產(chǎn)生。聚合酶的5’外切酶活性報(bào)告基團(tuán)R與淬滅基團(tuán)Q分離，發(fā)射熒光。RQReporterQuencherRQ熒光信號(hào)強(qiáng)度與結(jié)合探針的DNA分子成正比。第28頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月Taqman工作原理

在退火過程中，探針與靶序列結(jié)合探針被Taq酶的5’-3’外切酶活性剪切成片斷游離報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光在延伸過程中，探針部分與靶序列分離第29頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月

SYBRGreenI與Taqman對(duì)比Taqman特異性高--與特異靶序列結(jié)合對(duì)模板有選擇性--可進(jìn)行多重PCR反應(yīng)

SYBRGreenI

使用方便，成本低--僅需設(shè)計(jì)兩個(gè)引物通用性好--對(duì)DNA模板沒有選擇性第30頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月

熒光定量PCR解析方法絕對(duì)定量

樣本中核酸的量（拷貝數(shù)、微克）--檢測(cè)某給定血液樣本中的病毒顆粒數(shù)，有6000個(gè)拷貝相對(duì)定量

不同樣本中目的基因表達(dá)量的差異--腫瘤組織和正常組織相比

某個(gè)基因的表達(dá)量mRNA改變了多少倍，改變了60倍第31頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月絕對(duì)定量的步驟

拷貝數(shù)計(jì)算對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度濃度稀釋熒光定量PCR反應(yīng)建立標(biāo)準(zhǔn)品未知樣品Ct代入標(biāo)準(zhǔn)曲線確定拷貝數(shù)質(zhì)粒提取OD值測(cè)定計(jì)算待測(cè)樣本濃度/樣本分子量/待測(cè)樣本拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行5-6個(gè)梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)為10第32頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月絕對(duì)定量Sample--樣本起始濃度與Ct呈線性關(guān)系，根據(jù)已知拷貝的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。--根據(jù)未知樣品的Ct值，推算出未知樣本量。以標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)桿第33頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月相對(duì)定量參照樣本Calibrator用于比較結(jié)果的基準(zhǔn)。第34頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月相對(duì)定量特點(diǎn)選擇內(nèi)參基因內(nèi)參基因beta-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因housekeepinggene在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響較小--文獻(xiàn)檢索--實(shí)驗(yàn)篩選內(nèi)參基因--同樣體積或重量的樣本所來源的細(xì)胞數(shù)目不同。--RNA抽提、反轉(zhuǎn)效率不同，操作中存在誤差。對(duì)樣本初始濃度差異進(jìn)行均一化校正。第35頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月2-ΔΔCt法成立條件：假設(shè)擴(kuò)增效率為100%滿足條件：1）內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的擴(kuò)增效率接近2）內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的擴(kuò)增效率均為90%-110%假設(shè)條件：內(nèi)參基因和目標(biāo)基因擴(kuò)增效率差異大于5%1）優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，使擴(kuò)增效率接近2）使用其他方法

相對(duì)定量方法第36頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月2-ΔΔCt法

相對(duì)定量舉例第37頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月

相對(duì)定量分析

待測(cè)樣品目的基因濃度待測(cè)樣品內(nèi)參基因濃度

F=對(duì)照樣品目的基因濃度

對(duì)照樣品內(nèi)參基因濃度假設(shè)條件：內(nèi)參基因和目標(biāo)基因擴(kuò)增效率不同優(yōu)點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)優(yōu)化簡單缺點(diǎn)：每一輪實(shí)驗(yàn)都必需做標(biāo)準(zhǔn)曲線

雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法80%第38頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月

相對(duì)定量舉例

雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法第39頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月

實(shí)驗(yàn)流程第40頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月

SYBRGreen法實(shí)驗(yàn)流程樣本處理RNA提取qPCR數(shù)據(jù)分析逆轉(zhuǎn)錄第41頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月樣本處理與RNA提取外界刺激

–10min

–可檢測(cè)的表達(dá)改變樣品離開定義環(huán)境–2min–裂解、固定細(xì)胞TRIzon（酚、異硫氰酸胍）

裂解液（氰酸胍，異硫氰酸胍，SDS）液氮RNA保存液小心DNA污染！使用DNase陰性對(duì)照第42頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄引物選擇下游應(yīng)用：是否檢測(cè)其它基因？AbundantRNA的干擾：mRNAortotalRNA？檢測(cè)靈敏度是否足夠？第43頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月

RT-PCR一步法還是兩步法？兩步法:反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增分兩步進(jìn)行。步驟多但靈活多樣。cDNA可長期保留檢測(cè)多個(gè)基因。便于反應(yīng)優(yōu)化。在工作的初期。一步法：反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增在同一管內(nèi)完成。

簡便、快捷但只做一個(gè)基因，一旦失敗難以查找原因。在工作的成熟階段。第44頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光定量PCR體系Template

PrimersDNA聚合酶BufferanddNTPsDye第45頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月總原則與普通PCR相同：避免引物二聚體，避免二級(jí)結(jié)構(gòu)擴(kuò)增片段長度（80-300bp)推薦做跨intron設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)原則第46頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月Mastermix使用Mastermix有效降低系統(tǒng)誤差--熱啟動(dòng)酶Hotstar化學(xué)修飾，低溫下酶活抑制性強(qiáng)，熱復(fù)活需10minFastHotstar抗體修飾，熱復(fù)活僅需幾十秒--Buffer反應(yīng)增強(qiáng)劑減少模板二級(jí)結(jié)構(gòu)影響控制Mg2+濃度穩(wěn)定劑--DyeRealSYBRGreenmixRealSupermix第47頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月Mastermix的優(yōu)化

新型熒光染料(SuperGreen)激發(fā)、發(fā)射波長與SYBRGreen近似對(duì)PCR反應(yīng)抑制更輕微可使用較高濃度(>1uM,SYBRgreen<0.3uM)更亮，靈敏度更高較短的鏈延長時(shí)間對(duì)小片段DNA和ssDNA結(jié)合更弱減少背景，有效信號(hào)更強(qiáng)與更強(qiáng)的信號(hào)協(xié)同，使溶解曲線峰更窄，適合于HRM分析化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定致突變性與毒性更弱SYBRGreenSuperGreen第48頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月MasterMixROXPassiveReference不參與、不干擾PCR反應(yīng)恒定發(fā)射熒光信號(hào)用于校正因信號(hào)檢測(cè)器到各孔間光路不同而導(dǎo)致的系統(tǒng)誤差。有不同系統(tǒng)，需參照儀器要求選擇。第49頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月

誤差控制使用Mastermix配置預(yù)混體系設(shè)置生物學(xué)重復(fù)（不同個(gè)體）

技術(shù)性重復(fù)（復(fù)孔）陽性和陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)環(huán)境控制試劑準(zhǔn)備區(qū)核酸制備區(qū)反應(yīng)液制備區(qū)熒光定量PCR反應(yīng)區(qū)熒光定量PCR體系第50頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月數(shù)據(jù)分析融解曲線：單一特異性產(chǎn)物擴(kuò)增曲線：--Ct值大小--各復(fù)孔之間重復(fù)性--不同濃度梯度稀釋的間隔性標(biāo)準(zhǔn)曲線：--R2＞0.980或∣

r∣

＞0.990--反應(yīng)效率盡可能高：90%-110%--目的基因的擴(kuò)增效率接近內(nèi)參基因第51頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月操作注意事項(xiàng)為避免加樣誤差，保證重復(fù)性，配制預(yù)混體系配制反應(yīng)體系時(shí)，液體要緩慢加至管底，減少吹打低速離心，充分混勻，如有氣泡短暫離心不要直接在八連管上進(jìn)行標(biāo)記避光保存，試劑分裝避免反復(fù)凍融酒精擦拭移液器的吸頭設(shè)置反應(yīng)重復(fù)（至少二個(gè)）設(shè)置對(duì)照第52頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光定量PCR儀ABI730075007900Roche羅氏Bio-rad伯樂第53頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光定量PCR儀Agilent安捷倫QiagenRotor-GeneQCorbettRotor-Gene6000第54頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月案例分析總體原則偶然因素--操作原因?qū)嶒?yàn)重復(fù)–

生物學(xué)重復(fù)、技術(shù)性重復(fù)機(jī)器因素–

儀器加樣孔結(jié)合擴(kuò)增曲線、融解曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線分析單孔和多孔分析內(nèi)參基因和目的基因?qū)Ρ确治龅?5頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月案例分析–擴(kuò)增曲線曲線拐點(diǎn)清楚，特別是低濃度樣本指數(shù)期明顯。擴(kuò)增曲線整體平行性好，基線平而無上揚(yáng)現(xiàn)象。模板進(jìn)行梯度稀釋時(shí)，各濃度間隔性好。

C