顯微測試技術(shù)

顯微測試技術(shù)第1頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月一、顯微鏡發(fā)展歷史1665年1665年,英國科學(xué)家胡克用自己設(shè)計與制造的的簡易顯微鏡觀察櫟樹軟木塞切片時，發(fā)現(xiàn)其中有許多小室，他把這些小室稱為細(xì)胞，實(shí)際上胡克當(dāng)時看到的是細(xì)胞壁。這是人類發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的第一步。第2頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造目鏡粗準(zhǔn)焦螺旋鏡筒細(xì)準(zhǔn)焦螺旋轉(zhuǎn)換器物鏡鏡臂聚光器反光鏡鏡座第3頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月列文虎克觀察到的“小動物”第4頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月2、顯微鏡的分辨力分辨力是指顯微鏡（或人的眼睛距目標(biāo)25cm處）能分辨物體最小間隔的能力，分辨力的大小決定于光的波長和鏡口率以及介質(zhì)的折射率，用公式表示為：R=0.61λ/N．A．N．A．＝ｎsinα/2式中：n=介質(zhì)折射率；α=鏡口角（標(biāo)本對物鏡鏡口的張角），N.A.=鏡口率（numericaperture）。鏡口角總是要小于180?，所以sina/2的最大值必然小于1。第5頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月光學(xué)顯微鏡的原理1、在觀察樣品時，被觀察的物像通過物鏡到達(dá)目鏡，物像被兩次放大。所以放大倍數(shù)=物鏡的放大倍數(shù)×目鏡的放大倍數(shù)2、由于可見光的波長在380~760nm范圍內(nèi)，因此，最精確的光學(xué)顯微鏡的放大倍數(shù)也只有1500倍。第6頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月電子顯微鏡下的蚊子最早的電子顯微鏡高電壓下電子流波長很短（100000×）盧斯卡（ErnstRuska）20C30s1952年，英國工程師CharlesOatley制造出了第一臺掃描電子顯微鏡(SEM)。第7頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月二、偏光顯微鏡1·光的特征光是一種電磁波，振動方向與傳播方向垂直（橫波）,可見光是電磁波譜中的一段，波長3900～7700埃。3900～4460～4640～5000～5780～5920～6200～7700|紫|蘭|青|綠|黃|橙|紅|第8頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月2.自然光和偏振光

——自然光：垂直于光的傳播方向振動，在垂直于光的傳播方向的平面內(nèi)的任意方向振動。

——偏振光：垂直于光的傳播方向振動，且只在垂直于光的傳播方向的平面內(nèi)的某一方向振動。第9頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月當(dāng)光波從一種介質(zhì)傳到另一種介質(zhì)時，其傳播速度和方向會發(fā)生改變,這種現(xiàn)象叫折射。光在入射介質(zhì)中的傳播速度與折射介質(zhì)中的傳播速度之比，等于入射角正弦與折射角正弦之比。即

υ1/υ2=sini/sinr=n=n2/n1

當(dāng)兩種介質(zhì)一定時，n為一常數(shù)，稱為折射介質(zhì)相對入射介質(zhì)的相對折射率。n1(光蔬質(zhì))n2(光密質(zhì))ir第10頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月3.雙折射和單折射冰洲石下的繩子有兩個像玻璃下的繩子只有一個像雙折射單折射思考：雙折射、單折射產(chǎn)生的原因要了解雙折射、單折射產(chǎn)生的原因，必須先知道“均質(zhì)體”和“非均質(zhì)體觀察現(xiàn)象第11頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

根據(jù)光學(xué)性質(zhì)不同，將石礦物分為均質(zhì)體和非均質(zhì)體。第12頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月均質(zhì)體：等軸晶系和非晶質(zhì)寶石的光學(xué)性質(zhì)各方向相同稱為均質(zhì)體。如鉆石、玻璃等。均質(zhì)體只有一個折射率。光波在均質(zhì)體中傳播時，其振動特點(diǎn)和振動方向基本不改變。這一現(xiàn)象稱單折射。自然光A進(jìn)入均質(zhì)體后仍為自然光，偏振光B進(jìn)入均質(zhì)體后仍為偏振光，且其振動方向不改變。第13頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

非均質(zhì)體：中級晶族和低級晶族礦物的光學(xué)性質(zhì)隨方向而異稱為非均質(zhì)體。非均質(zhì)體的折射率值有多個。如紅寶石、橄攬石等。光波進(jìn)入非均質(zhì)體寶石時，除特殊方向外，一般分解成振動方向互相垂直、傳播速度不等的兩束偏振光。這一現(xiàn)象稱雙折射。光波沿非均質(zhì)體的特殊方入射時不發(fā)生雙折射，這特殊方向為光軸方向。中級晶族寶石只有一個光軸方向，稱為一軸晶；低級晶族寶石有兩個光軸方向，稱為二軸晶。自然光在非均質(zhì)體中的傳播第14頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月均質(zhì)體、非均質(zhì)體與晶系的關(guān)系及光在均質(zhì)體和非均質(zhì)體中的傳播特點(diǎn)均質(zhì)體—等軸晶系—單折射

(一個折射率)非光軸方向入射產(chǎn)生雙折射分解成振動方向互相垂直的兩束偏振光非均質(zhì)體一軸晶(2個主折射率)二軸晶(3個主折射率)自然光進(jìn)自然光出偏振光進(jìn)偏振光出三斜晶系單斜晶系斜方晶系三方晶系四方晶系六方晶系光軸方向入射：自然光進(jìn)自然光出偏振光進(jìn)偏振光出第15頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月4、雙折射現(xiàn)象：

一軸晶只有一個方向不發(fā)生雙折射，即一根光軸此類晶體有三方晶系、四方晶系、六方晶系體二軸晶有兩個方向不發(fā)生雙折射，即兩根光軸此類晶體有斜方晶系、單斜晶系、三斜晶系光入射非均質(zhì)體，產(chǎn)生兩條振動方向垂直的光波，這種現(xiàn)象稱為雙折射光波入射光性非均質(zhì)體中只有特定方向不產(chǎn)生雙折射，不發(fā)生雙折射的特殊方向稱為光軸。第16頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月偏振光顯微鏡偏光顯微鏡是一種能區(qū)別均質(zhì)與非均質(zhì)物體，而且還能觀察研究物體非均質(zhì)性本身強(qiáng)弱和各種差異的顯微鏡。偏振光

光的振動方向與波的傳播方向垂直。且其振動的方向隨機(jī)分布，在各個方向振動的強(qiáng)度也相等。如果光被某些特殊物體反射或透射后，其反射光的振動方向被限制在垂直光波傳播方向的一個直線上振動，這種光波稱為偏振光，也稱為完全偏振光。如果光波在某個方向上的振動強(qiáng)度比其它方向的振動強(qiáng)度大，則這種光波稱為部分偏振光。

雙折射體

自然界中的物質(zhì)存在著人的肉眼無法觀察到的均質(zhì)與非均質(zhì)的差別。非均質(zhì)物質(zhì)具有雙折射性質(zhì)。自然光通過“雙折射體”后，可形成兩束振動方向互相垂直的偏振光（正常光和異常光），兩者的光速、折射率和波長均有不同。第17頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

1、偏光顯微鏡在光源與樣品之間，加有起偏器，通過其獲得偏振光；在物鏡與目鏡之間裝有檢偏器，用以檢查是否有異常光通過雙折射體。2、當(dāng)起偏器與檢偏器的方向平行時，通過起偏器的光振動恰好能通過檢偏器，其視野是亮的；轉(zhuǎn)動起偏器，使起偏器通過的光振動方向與檢偏器通過的光振動方向相垂直，其視野是暗的。此時在載物臺上放入具有雙折射性質(zhì)的非均質(zhì)物質(zhì)，由于產(chǎn)生偏光干涉而使視野變亮。而放入單折射體時，視野中的物像始終是暗的。據(jù)此可以判斷樣品是雙折射體還是單折射體。偏振器

偏振器是用尼科爾棱鏡制成的、只允許在一個方向振動的光波通過的光學(xué)元件，分為起偏器和檢偏器兩種。工作原理

在偏光顯微鏡下觀察具有雙折射性的物體時，不僅視野明亮，還可以看到顏色，即偏光干涉圖。偏光干涉圖反映了物質(zhì)本身分子結(jié)構(gòu)的圖形，其色彩和形狀等是由雙折射體的種類、厚度、橫截面形狀及本身固有的雙折射性質(zhì)所決定的。據(jù)此可以推定物質(zhì)種類，區(qū)別各種被檢物，比較其異同。第18頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月自然光通過偏振棱鏡或人造偏振片可獲得偏振光。利用偏光原理，可對某些物質(zhì)具有的偏光性進(jìn)行觀察的顯微鏡，就稱為偏振光顯微鏡。偏光顯微鏡的成像原理是在光路中插入兩個偏光鏡。一個在載物臺下方，稱為下偏光鏡，用來產(chǎn)生偏光，故又稱起偏鏡；另一個在載物臺上方的鏡筒內(nèi)，稱為上偏光鏡，它被用來檢查偏光的存在，故又稱檢偏鏡。將普通光改變?yōu)槠窆膺M(jìn)行鏡檢的方法，以鑒別某一物質(zhì)是單折射（各向同行）或雙折射性（各向異性）。雙折射性是晶體的基本特性。因此，偏光顯微鏡被廣泛地應(yīng)用在礦物、化學(xué)等領(lǐng)域，在生物學(xué)和植物學(xué)也有應(yīng)用。

第19頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月1、電子顯微鏡及電子顯微術(shù)概況近年來，電鏡的研究和制造有了很大的發(fā)展。一方面，電鏡的分辨率不斷提高，透射電鏡的點(diǎn)分辨率達(dá)到了0.2-0.3nm，晶格分辨率已經(jīng)達(dá)到0.1nm左右，通過電鏡，人們已經(jīng)能直接觀察到原子像；另一方面，除透射電鏡外，還發(fā)展了多種電鏡，如掃描電鏡、透射電鏡等。三、電子顯微鏡第20頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月1．透射電鏡（TEM）透射電鏡即透射電子顯微鏡（TransmissionElectronMicroscope，簡稱TEM），通常稱作電子顯微鏡或電鏡（EM），是使用最為廣泛的一類電鏡。第21頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月工作原理：利用電子射線（或稱電子束也稱電子波）穿透樣品，而后經(jīng)多級電子放大后成像于熒光屏。主要優(yōu)點(diǎn)：分辨率高，可用來觀察組織和細(xì)胞內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)以及微生物和生物大分子的全貌。第22頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月根據(jù)加速電壓的大小分為以下3種：（1）一般TEM。最常用的是100KV電鏡。這種電鏡分辨率高（點(diǎn)0.3nm，晶格0.14nm），但穿透本領(lǐng)小，觀察樣品必須很薄，約為30～100nm，如細(xì)胞和組織的超薄切片、復(fù)型膜和負(fù)染樣品等。相當(dāng)普及。我校有這樣的設(shè)備。（2）高壓TEM。目前常用的是200KV電鏡。這種電鏡對樣品的穿透本領(lǐng)約為100KV電鏡的1.6倍，可以在觀察較厚樣品時獲得很好的分辨本領(lǐng)，從而可以對細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行三維觀察。（3）超高壓TEM。目前已有500KV、1000KV和3000KV的超高壓TEM。這類電鏡具有穿透本領(lǐng)強(qiáng)、輻射損傷小、可以配備環(huán)境樣品室及進(jìn)行各種動態(tài)觀察等優(yōu)點(diǎn)，分辨率也已達(dá)到或超過100KV電鏡的水平。在超高壓電鏡上附加充氣樣品室，使人們可以觀察活細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)動態(tài)變化。第23頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月2．掃描電鏡（SEM）掃描電鏡即掃描電子顯微鏡（ScanningElectronMicroscope，簡稱SEM）。主要用于觀察樣品的表面形貌、割裂面結(jié)構(gòu)、管腔內(nèi)表面的結(jié)構(gòu)等。第24頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月掃描電鏡原理第25頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月工作原理：利用電子射線轟擊樣品表面，引起二次電子等信號的發(fā)射，經(jīng)檢測裝置接收后成像的一類電鏡。主要優(yōu)點(diǎn)：景深長，所獲得的圖像立體感強(qiáng)，可用來觀察礦物樣品的各種形貌特征。第26頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月一些電鏡圖片染色體染色體被精子包圍的卵子骨髓細(xì)胞SARSAIDS第27頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月依據(jù)性能不同主要分為：（1）一般SEM。目前一般掃描電鏡采用熱發(fā)射電子槍，分辨率為6nm左右，若采用六硼化鑭電子槍，分辨率可提高到4～5nm。我校有這樣的設(shè)備。（2）場發(fā)射電子槍SEM。由于場發(fā)射電子槍具有亮度高、能量分散少，陰極源尺寸小等優(yōu)點(diǎn)，這種電鏡的分辨率已達(dá)到3nm。場發(fā)射電子槍SEM的另一個優(yōu)點(diǎn)是可以在低加速電壓下進(jìn)行高分辨率觀察，因此可以直接觀察絕緣體而不發(fā)生充、放電現(xiàn)象。（3）生物用SEM。這種SEM備有冰凍冷熱樣品臺，可把含水生物樣品迅速冷凍并對冰凍樣品進(jìn)行觀察，可以減少化學(xué)處理引起的人為變化，使觀察樣品更接近于自然狀態(tài)。如要觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)，還可用冷刀把樣品進(jìn)行切開，加溫使冰升華，并在其上噴鍍一層金屬再進(jìn)行觀察，所有這些過程都在SEM中不破壞真空的狀態(tài)下進(jìn)行。第28頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月3．掃描隧道顯微鏡/電子探針顯微鏡電子探針主要用于探測微小區(qū)域的元素成分。其原義僅是一個物理學(xué)名詞，意指聚焦了的電子束。當(dāng)電子束照射樣品表面時，可激發(fā)X射線，X射線光量子的能量及波長與元素的原子序數(shù)有關(guān)，稱為特征X射線。采用晶體分光光譜法測定X射線的波長和強(qiáng)度來分析樣品成分的儀器，稱為X射線分光光譜儀或電子探針；用鋰漂移硅探頭測定X射線能量和強(qiáng)度的儀器稱為X射線能譜儀。第29頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月掃描隧道顯微鏡及原理第30頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月掃描隧道顯微鏡圖片硅表面納米算盤由單個原子構(gòu)成的“IBM”第31頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）電子顯微術(shù)電鏡具有很高的分辨本領(lǐng)，能觀察極微小的結(jié)構(gòu)。但是電鏡不能直接觀察天然狀態(tài)下的生物標(biāo)本，必須通過各種技術(shù)將生物標(biāo)本制成特殊的電鏡生物樣品，才能放入電鏡進(jìn)行觀察，這些電鏡樣品制備技術(shù)稱為電子顯微術(shù)。電子顯微術(shù)：將標(biāo)本制成特殊的電鏡觀察用樣品的制備技術(shù)。第32頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月1．與TEM有關(guān)的電子顯微術(shù)（1）超薄切片技術(shù)。超薄切片技術(shù)就是通過固定、脫水、包埋、切片和染色等步驟，將生物標(biāo)本切成薄于0.1μm的超薄切片的樣品制備技術(shù)，用于生物組織的內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)研究。第33頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月上圖超薄切片機(jī)局部下圖玻璃刀制作儀第34頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）負(fù)染色技術(shù)。利用電子密度比標(biāo)本高的重金屬鹽（如磷鎢酸鈉、醋酸鈾等）將生物標(biāo)本包圍起來，增強(qiáng)背景散射電子的能力以提高反差，在黑暗的背景下顯示標(biāo)本的形態(tài)結(jié)構(gòu)，稱負(fù)染色技術(shù)。這一技術(shù)操作簡便，主要用于顆粒狀標(biāo)本（如細(xì)菌、病毒、分離細(xì)胞器等）的研究。（3）冷凍蝕刻技術(shù)。在快速冷凍下對生物樣品進(jìn)行斷裂、蝕刻和復(fù)型，制備生物樣品復(fù)型膜的技術(shù)稱冷凍蝕刻技術(shù)。在電鏡下觀察復(fù)型膜可獲得立體感強(qiáng)的超微結(jié)構(gòu)圖像，主要用于生物膜結(jié)構(gòu)的研究。第35頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月（4）電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。在超微結(jié)構(gòu)水平上，通過電鏡細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)來研究細(xì)胞成分的分布和變化的方法稱電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。這一技術(shù)把細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)與其化學(xué)組成有機(jī)地結(jié)合起來，目前主要用于研究細(xì)胞內(nèi)各種大分子物質(zhì)和酶的定位等。（5）免疫電鏡技術(shù)。這是一種使抗原在超微結(jié)構(gòu)水平上定位的技術(shù)，應(yīng)用與抗原相應(yīng)的標(biāo)記抗體，在電鏡下觀察標(biāo)記物的位置，從而定位相應(yīng)抗原。這一技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。（6）電鏡放射自顯影技術(shù)。這是電鏡技術(shù)與放射自顯影技術(shù)相結(jié)合，觀察放射性物質(zhì)在超微結(jié)構(gòu)水平上的定位和變化，從而了解細(xì)胞的各種代謝活動。這一技術(shù)使結(jié)構(gòu)與功能的研究結(jié)合起來，是一種動態(tài)的研究方法。第36頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月2．與SEM有關(guān)的電子顯微術(shù)（1）SEM常規(guī)制樣技術(shù)。SEM適合于研究生物樣品的表面特征，樣品制備包括樣品觀察面的暴露、固定、干燥和導(dǎo)電等步驟，使表面特征充分暴露而不變形。這一技術(shù)是SEM樣品制備的常規(guī)技術(shù)，主要用于組織、細(xì)胞、寄生蟲等表面形貌的研究。下圖為SEM標(biāo)本處理設(shè)備。第37頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月大鼠睪丸精子細(xì)胞左上青年對照左下老年對照右上二仙湯組右中溫腎組右下瀉火組第38頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月能譜儀（ED