流式細(xì)胞術(shù)的原理和臨床

流式細(xì)胞術(shù)的原理和臨床第1頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月溴脫氧脲嘧啶核苷替代胸腺嘧啶脫氧核苷參與DNA的合成，測定DNA的合成速率。異染性熒光染料AO，同染DNA、RNA識別G0/G1期。第2頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月二．測定細(xì)胞周期蛋白、癌基因及抗癌基因蛋白對細(xì)胞周期調(diào)節(jié)機(jī)理研究進(jìn)展較快，真核細(xì)胞的增殖是控制在細(xì)胞周期的特定階段，特別是在G1到S期以及G2到M期移行部位。Cyclin（周期蛋白）作為Cyclin依賴性cdk復(fù)合體的調(diào)節(jié)亞單位，對細(xì)胞周期起重要的調(diào)節(jié)作用。第3頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月Cyclin家族中有8種CyclinA、B、C、D、E、F、J、H。CyclinA、B、F及E在細(xì)胞周期中不間斷的表達(dá)。這些蛋白質(zhì)合成及降解構(gòu)成了細(xì)胞周期的特征性。增殖細(xì)胞核抗原PCNA是一穩(wěn)定的細(xì)胞周期相關(guān)性核蛋白，在G1期和S早期，PCNA水平升高2~3倍，在G2期保持低值。Ki-67核抗原可見細(xì)胞周期全過程，而靜止期G0無表達(dá)。第4頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月C-erB-2，產(chǎn)物是分子量為190KD跨膜糖蛋白，其結(jié)構(gòu)類似于表皮生長因子受體，過表達(dá)C-erb常常與腫瘤細(xì)胞較快增生及病人預(yù)后有關(guān)，使用FCM可測定C-erb-2在乳腺癌等中的表達(dá)，并可進(jìn)而分析與病人預(yù)后的關(guān)系。第5頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月MYC基因家族由C-MYC、N-MYC及L-MYC構(gòu)成，也是與細(xì)胞增殖有關(guān)的癌基因，最近的研究提示MYC基因與凋亡的誘導(dǎo)有關(guān)。P53已被認(rèn)為是一種抗癌基因。野生型P53蛋白是一種細(xì)胞生長抑制物，能阻斷細(xì)胞周期循環(huán)。人類的許多惡性腫瘤中，可見P53突變，用FCM可以測定P53在癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，從而評估診斷和預(yù)后。第6頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月P53TumourSuppressorGene第7頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月Humanp53Protein–AntibodyMappingSites第8頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月三．細(xì)胞內(nèi)PH及Ca2+測定

Ca2+除了作為細(xì)胞內(nèi)許多關(guān)鍵和功能蛋白的輔基之外，還是重要的細(xì)胞內(nèi)信使，測定細(xì)胞內(nèi)Ca2+的變化，對于了解細(xì)胞內(nèi)信息傳遞，細(xì)胞調(diào)亡等都有一定的意義。使用Ca2+特異的Fluo—3染料標(biāo)記細(xì)胞可用FCM測定Ca2+的變化。用SNARF—1標(biāo)記細(xì)胞，用FCM可測定細(xì)胞內(nèi)PH，例如癌細(xì)胞在受到加熱或化療細(xì)胞內(nèi)PH下降。第9頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月四．細(xì)胞凋亡研究上的應(yīng)用

細(xì)胞死亡在多細(xì)胞生物通過兩種機(jī)理而產(chǎn)生，即凋亡和壞死。凋亡不僅與個體形成等基本生命現(xiàn)象有關(guān)，而且與癌、AIDS等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。電泳分析可見DNA呈階梯狀改變。使用FCM能精確定量凋亡細(xì)胞，同時可進(jìn)行多參數(shù)分析。第10頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月原位標(biāo)記DNA斷裂的方法已用來鑒別凋亡的細(xì)胞，使用生物素或地高辛標(biāo)記的脫氧核苷酸在外源性DNA聚合酶或TdT作用下，標(biāo)記3`-OH。熒光素標(biāo)記的二抗與其結(jié)合，用流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡細(xì)胞。第11頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月凋亡蛋白的檢測：反映細(xì)胞凋亡的早期蛋白AnnexitV

其他P53蛋白、Myc蛋白、bcl-2蛋白、Bax蛋白等等。第12頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月五、多藥耐藥檢測近年來的研究發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞耐藥性與癌細(xì)胞內(nèi)存在耐藥基因有關(guān)。多藥耐藥基因（multidrugresistantgene,MDR）的產(chǎn)物為P-糖蛋白（P-GP或P-170）。P-170是分子量為170KD的跨膜蛋白，利用ATP的能量將抗癌藥物排出細(xì)胞外。除在正常細(xì)胞上表達(dá)外，常常在許多實(shí)體腫瘤細(xì)胞及白血病中高表達(dá)，提示耐藥性增高。故對于腫瘤化療病人，檢測P-170有重要的臨床意義，可指導(dǎo)癌癥治療。第13頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月用抗P-170抗體標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)可直接測定P-170表達(dá)。也可用羅丹明熒光染料作為被測抗癌藥物在細(xì)胞中的積聚。在耐藥細(xì)胞有P-170糖蛋白的過表達(dá)，使進(jìn)入細(xì)胞的羅丹明熒光染料可以被泵出細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)的羅丹明減少，熒光強(qiáng)度降低，可以用FCM檢測。第14頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)中的應(yīng)用

一、細(xì)胞表面標(biāo)記及抗原決定簇性質(zhì)的研究流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)胞表面標(biāo)記，特別是腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)記的研究中，以及在細(xì)胞分類和亞群的分析上，開始了一場細(xì)胞免疫學(xué)的革命。尤其在細(xì)胞表面標(biāo)記分析上，占有舉足輕重的地位。第15頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月1．1血液系統(tǒng)細(xì)胞表面標(biāo)記的研究可用于白血病細(xì)胞的免疫分型和淋巴瘤的研究。1．2細(xì)胞群體及細(xì)胞表面標(biāo)記變化的檢測可以發(fā)現(xiàn)體內(nèi)外細(xì)胞表型及細(xì)胞亞群的微小變化，有利于發(fā)現(xiàn)惡變的腫瘤細(xì)胞，或在免疫治療及宿主排異反應(yīng)中抗原決定簇發(fā)生改變的細(xì)胞群體。第16頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月第17頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月1．3細(xì)胞表面抗原決定簇性質(zhì)研究1．4細(xì)胞表面標(biāo)記的分子變化的定量分析1．5細(xì)胞抗原表達(dá)的研究第18頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞抗原的表達(dá)和細(xì)胞的其他生物和生化變化一樣，是細(xì)胞增殖和增殖活動中的一種現(xiàn)象。研究正常和腫瘤細(xì)胞增殖、分化及周期活動中抗原表達(dá)，對于加深對腫瘤發(fā)生、發(fā)展、腫瘤細(xì)胞及腫瘤實(shí)體的異質(zhì)性，腫瘤入侵轉(zhuǎn)移的認(rèn)識和它們同腫瘤診治，耐藥性的認(rèn)識是十分重要的。第19頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月一、臨床免疫學(xué)中的應(yīng)用1、機(jī)體免疫狀態(tài)評估就用FCM及熒光染料標(biāo)記的特導(dǎo)性單克隆抗體，可對細(xì)胞表面標(biāo)記物進(jìn)行研究。結(jié)合細(xì)胞分選技術(shù)，將分選同鑒定結(jié)合進(jìn)行，可分離出所需的細(xì)胞群體，純度可達(dá)95%以上?，F(xiàn)在命名的CD系列已有130種細(xì)胞表面分化抗原，可分選、分析出外周血細(xì)胞、亞群及亞群中的亞群，也可以對循環(huán)免疫復(fù)合物及其它免疫指標(biāo)檢測。例如，HLA-B27檢測，其抗原陽性與強(qiáng)直性脊柱炎及炎癥性腸病等有不同程度的正相關(guān)。第20頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月用于免疫細(xì)胞表型分析的基本抗體IgG1/IgG2CD3/CD8CD45/CD14CD3/CD16+56CD3/CD4CD19第21頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月1．1免疫缺陷病它是由于機(jī)體免疫系統(tǒng)先天發(fā)育不全或后天受損所致的一種臨床綜合癥。用FCM行T細(xì)胞表型分析大多數(shù)可用于分類診斷先天性或獲得性的免疫缺陷綜合癥。如大多數(shù)伴嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（SCID）的患者血中缺乏成熟的T細(xì)胞，個別病例血中有循環(huán)T細(xì)胞，但表型異常。第22頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月AIDS，大多數(shù)有明顯的T4/T8降低，應(yīng)用FCM行T4、T8細(xì)胞計(jì)數(shù)及T4/T8比值測定，可作為排除診斷的方法。第23頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月1．2感染免疫防御的作用之一是抗感染作用。用FCM分類計(jì)數(shù)功能，可監(jiān)測不同感染中淋巴細(xì)胞的變化。例如，皰疹病毒感染的特點(diǎn)是：T8+的細(xì)胞數(shù)目和比例增高，有時可見T8表面有DR抗原。另外，在細(xì)菌感染中可有T4/T8增高。第24頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月1．3

腫瘤一般認(rèn)為機(jī)體免疫低不是腫瘤的始動因素，而細(xì)胞一旦發(fā)生癌變，機(jī)體免疫系統(tǒng)即對癌細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)答，其結(jié)果是消滅腫瘤細(xì)胞，終止腫瘤的發(fā)展。應(yīng)用FCM可檢測腫瘤相關(guān)抗原，并可對DNA、RNA的變化及淋巴細(xì)胞分類進(jìn)行監(jiān)測，對腫瘤起至監(jiān)測、預(yù)后評估的作用。第25頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月1．3．1

淋巴瘤、白血?。嚎梢詤f(xié)助確定細(xì)胞來源，協(xié)助臨床診斷和治療。1．3．2

其它腫瘤：利用一些特異性的標(biāo)記物，可以幫助腫瘤的早期診斷和治療?？傊?，利用FCM檢測表面抗原、細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA含量可以發(fā)現(xiàn)惡變的腫瘤細(xì)胞。另外應(yīng)用FCM研究正常和腫瘤細(xì)胞增殖、分化及周期活動中抗原的表達(dá)，對認(rèn)識腫瘤發(fā)生、發(fā)展、瘤細(xì)胞及腫瘤的異質(zhì)性，腫瘤轉(zhuǎn)移、診斷、治療、藥物耐藥性的關(guān)系有重要意義。從而可用于臨床腫瘤治療中的臨測，用藥指導(dǎo)及預(yù)后評估。第26頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月1．4自身免疫疾病自身免疫疾病的根本病因是自身成分具有抗原性和自身耐受性的破壞。用FCM對淋巴細(xì)胞亞群分類計(jì)數(shù)、測定循環(huán)免疫復(fù)合物及某些免疫指標(biāo)，從而監(jiān)測和診斷自身免疫性疾病。第27頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月1．4免疫抑制劑和免疫增強(qiáng)劑二者均可對免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，引起相應(yīng)的免疫細(xì)胞水平的變化。前者常用的是：糖皮質(zhì)激素、CTX、硫唑嘌呤等，后者常用的是：卡介苗、左旋咪唑等。用FCM可檢測到用藥后免疫細(xì)胞的變化。如：糖皮質(zhì)激素可降低T4+水平，從而可用于疾病急性期限。環(huán)磷酰胺開始用時對T細(xì)胞影響小，2月后則出現(xiàn)T8+細(xì)胞增高。所以應(yīng)用FCM可通過免疫監(jiān)測來指導(dǎo)用藥，在不產(chǎn)生藥物副作用的情況下發(fā)揮藥物的最大作用。第28頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月2.器官移植中的作用2.1

移植前監(jiān)測FCM在移植前配型中有重要作用。其重要性在于抗體檢測的特異性、敏感性和檢測結(jié)果與移植結(jié)果的一致性。用它不僅可以檢測ABO抗原抗體，還可檢測抗HLAI和II類抗原抗體，保證了供、受體ABO及HLA的基本一致性。第29頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月2．2移植后監(jiān)測FCM在監(jiān)測移植后免疫狀態(tài)變化及免疫抑制劑、全身免疫抑制劑過程是必不可少的有效手段。另外還可以檢測抗異體蛋白，如：抗淋巴細(xì)胞IgG及用于免疫抑制的Mabs抗體的出現(xiàn)及特異性，從而對是否發(fā)生免疫排斥及急性早期排斥有一定意義。第30頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月2．2臨床應(yīng)用2．3．1腎：現(xiàn)已將T細(xì)胞亞群分析作為監(jiān)測同種異體腎移植受者免疫狀態(tài)的一種方法。骨髓：FCM的細(xì)胞表型分析使免疫重建的監(jiān)測和對新生的免疫生物學(xué)狀態(tài)的了解成為可能。第31頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月3.免疫治療：許多疾病與免疫系統(tǒng)功能發(fā)生障礙有關(guān)，而某些疾病則是在病程中出現(xiàn)能變化。3.1FK-506及天花粉蛋白兩者均為高效免疫抑制劑。已用于臨床。用FCM通過監(jiān)測人的免疫水平來判斷療效并調(diào)整藥物及用量。第32頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月3.2

IL—2它是免疫系統(tǒng)中重要的細(xì)胞因子。用FCM檢測可發(fā)現(xiàn)：IL-2在離體時可誘導(dǎo)來源HIV患者外周血的單核細(xì)胞增生分化。發(fā)現(xiàn)IL-2治療可使CD4細(xì)胞提高>50%，故可周期性地用于HIV患者。第33頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月3.3腫瘤免疫治療近年來有了很大的進(jìn)步。例如用IL-2活化的LAK細(xì)胞治療腎癌、黑色素瘤、直腸癌等有一定療效。用FCM可以估計(jì)治療前后淋巴細(xì)胞亞群的變化以及活化狀態(tài)，并判斷免疫治療的有效性。第34頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月3.4移植免疫治療目前臨床移植配型以血清和細(xì)胞學(xué)為主，基因配型亦有發(fā)展。FCM移植配型的臨床重要性在于抗體檢測的特異性，敏感性以及結(jié)果和移植結(jié)果的相關(guān)一致性。FCM在監(jiān)測移植后免疫狀態(tài)變化和免疫抑制劑的療效評估中是一項(xiàng)不可缺少的有效手段。第35頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用

一.腫瘤診斷包括監(jiān)測癌前期病變，腫瘤早期診斷，交界性腫瘤診斷和腫瘤細(xì)胞學(xué)診斷等各方面。DNA非整倍體的出現(xiàn)可能是癌變的一個重要標(biāo)志，細(xì)胞的增殖能力大小也可反映腫瘤的生物學(xué)特性。因此，臨床上可利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期分析和DNA倍體分析，輔助腫瘤診斷。第36頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月一.腫瘤預(yù)后估計(jì)在病理組織學(xué)分級，臨床分期等指標(biāo)基礎(chǔ)上，腫瘤DNA倍體可更客觀地預(yù)測預(yù)后。通常，異倍體腫瘤惡性度、復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率、死亡率都較二倍體腫瘤要高。已有文獻(xiàn)報(bào)道，在乳腺、結(jié)腸、直腸、前列腺和膀胱腫瘤中，異倍體和/或較高的S期百分比都是不良預(yù)后的標(biāo)志。同樣地，在肺、