流式細(xì)胞術(shù)-課件

一、

流式細(xì)胞術(shù)的概念流式細(xì)胞術(shù)（FCM）就是對(duì)在高速流動(dòng)的鞘液包括下的細(xì)胞、粒子進(jìn)行分析和分選的技術(shù)，這種細(xì)胞或粒子是經(jīng)過(guò)特異熒光標(biāo)記的。其特點(diǎn)是測(cè)量速度快，每秒鐘能測(cè)數(shù)千個(gè)乃至上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，且可進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量，另一特點(diǎn)是在分析的同時(shí)可把具有指定特征的細(xì)胞分離出來(lái)，這就是分選技術(shù)。1ppt課件

二、流式細(xì)胞儀的工作原理待測(cè)細(xì)胞被制成單個(gè)細(xì)胞的懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色后放入樣品管中，在清潔氣體的壓力下進(jìn)入流動(dòng)室。流動(dòng)室內(nèi)充滿鞘液，鞘液的作用有二：一是約束樣品使之在噴嘴中心以提高測(cè)量精度；二是防止樣品靠近噴孔壁以避免堵塞噴孔。在這種約束作用下，細(xì)胞排成單列一個(gè)跟隨一個(gè)地在鞘液包括下由流動(dòng)室下面的噴嘴中心噴出，形成細(xì)胞液柱。液柱與入射的高度聚焦的激光束相交，此時(shí)，細(xì)胞上的熒光染料被激發(fā)而產(chǎn)生特異性熒光。在與入射激光和液柱都垂直的方向設(shè)置有熒光測(cè)量系統(tǒng)，包括透鏡、光闌、濾片、檢測(cè)器等，將細(xì)胞的熒光信號(hào)變成電信號(hào)輸出到計(jì)算機(jī)，用專用軟件進(jìn)行分析。2ppt課件精品資料你怎么稱呼老師？如果老師最后沒(méi)有總結(jié)一節(jié)課的重點(diǎn)的難點(diǎn)，你是否會(huì)認(rèn)為老師的教學(xué)方法需要改進(jìn)？你所經(jīng)歷的課堂，是講座式還是討論式？教師的教鞭“不怕太陽(yáng)曬，也不怕那風(fēng)雨狂，只怕先生罵我笨，沒(méi)有學(xué)問(wèn)無(wú)顏見(jiàn)爹娘……”“太陽(yáng)當(dāng)空照，花兒對(duì)我笑，小鳥(niǎo)說(shuō)早早早……”三、流式細(xì)胞儀可檢測(cè)到的細(xì)胞參數(shù)

1前向角散射（FSC）：前向角散射光的強(qiáng)度與細(xì)胞的大小有關(guān)，也就是說(shuō)，同一個(gè)細(xì)胞群體，F(xiàn)SC強(qiáng)的，其細(xì)胞大一些，而FSC弱的，其細(xì)胞小一些。

2側(cè)向角散射（SSC）：側(cè)向角散射又稱90°散射或大角散射。側(cè)向角散射光對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，對(duì)胞內(nèi)較大的顆粒也會(huì)有反應(yīng)。所以，側(cè)向角散射光的強(qiáng)弱可反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒的性質(zhì)。5ppt課件3熒光強(qiáng)度（FL）：是細(xì)胞或細(xì)胞上的熒光染料被激光激發(fā)后發(fā)射出的熒光，不同的熒光染料其發(fā)射波長(zhǎng)不同。通過(guò)熒光強(qiáng)度可將同一個(gè)細(xì)胞群體中的有熒光標(biāo)記的細(xì)胞與無(wú)熒光標(biāo)記的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)，也就是我們通常所說(shuō)的陽(yáng)性細(xì)胞，也可以將陽(yáng)性細(xì)胞中的高FL的細(xì)胞與低FL的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)，也就是可以把強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞和弱陽(yáng)性細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。一般的流式細(xì)胞儀只裝有一個(gè)激光光源（488nm），可測(cè)出三個(gè)FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式細(xì)胞儀裝有兩個(gè)或三個(gè)激光光源（488nm、633nm和325nm），可測(cè)出6個(gè)FL。6ppt課件

四、流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用

1細(xì)胞DNA含量檢測(cè)：

細(xì)胞固定后用PI染色，因?yàn)镻I特異性結(jié)合于細(xì)胞DNA，熒光強(qiáng)度與PI的結(jié)合量呈良好的線性關(guān)系，根據(jù)這個(gè)原理，并通過(guò)專用的DNA分析軟件，可測(cè)出細(xì)胞的DNA含量。用于細(xì)胞周期、細(xì)胞倍體以及凋亡的檢測(cè)。7ppt課件腫瘤診斷：

DNA異倍體的出現(xiàn)是癌變的一個(gè)重要標(biāo)志，細(xì)胞的增殖能力的大小也可反映腫瘤的生物學(xué)特征。因此，臨床上可利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析和DNA倍性分析，輔助腫瘤診斷，包括監(jiān)測(cè)癌前病變、腫瘤的早期診斷、交界性腫瘤診斷和腫瘤細(xì)胞學(xué)診斷等各方面。8ppt課件

腫瘤預(yù)后估計(jì)：異倍體腫瘤惡性度、復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率和死亡率都較二倍體腫瘤高。已有文獻(xiàn)報(bào)道，在乳腺、結(jié)腸、直腸、前列腺和膀胱腫瘤中，異倍體和較高的S期百分比都是不良預(yù)后的標(biāo)志。同樣的，在肺癌、頭預(yù)部腫瘤、卵巢癌、腎癌、子宮內(nèi)膜癌、黑色素瘤和白血病中，亦有類似發(fā)現(xiàn)。因此在病理組織學(xué)分級(jí)、臨床分期等指標(biāo)基礎(chǔ)上，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤DNA倍體能更客觀地預(yù)測(cè)預(yù)后。9ppt課件凋亡：由于凋亡細(xì)胞核酸內(nèi)切酶活化，DNA降解，細(xì)胞DNA減少，因而可在G0/G1峰前出現(xiàn)一個(gè)亞二倍體峰，也就是凋亡峰。檢測(cè)調(diào)亡，可進(jìn)行抗腫瘤藥物研究和某些因素對(duì)細(xì)胞的損傷機(jī)理的研究。10ppt課件

細(xì)胞表型的分析得益于單克隆抗體的產(chǎn)生及發(fā)展，現(xiàn)在CD系統(tǒng)已有247種之多。細(xì)胞用帶有熒光的單克隆抗體標(biāo)記后，用流式細(xì)胞儀可對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)分析，可分析出熒光細(xì)胞的含量，也可分析出這種陽(yáng)性細(xì)胞的CD分子的相對(duì)含量。標(biāo)記的方法一般用直標(biāo)法，也可用間標(biāo)法。熒光探針多為FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、APC等。

2細(xì)胞表型分析：11ppt課件

淋巴細(xì)胞分類：

CD3(T細(xì)胞，CD4、CD8))、CD19（B細(xì)胞）、CD16、CD56（NK細(xì)胞），原發(fā)性或繼發(fā)性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴細(xì)胞增殖病、腫瘤療效觀察與預(yù)后判斷、移植免疫檢測(cè)等。12ppt課件

造血干/祖細(xì)胞計(jì)數(shù)造血干/祖細(xì)胞存在于骨髓和外周血中，形態(tài)與淋巴細(xì)胞相似，用普通形態(tài)學(xué)方法難以識(shí)別。由于造血干/祖細(xì)胞表面可表達(dá)CD34和CD45抗原且具有很高的核酸含量，因而用CD34和CD45單克隆抗體和核酸染料進(jìn)行三色熒光標(biāo)記，F(xiàn)CM多參數(shù)分析血液、骨髓和濃縮白細(xì)胞懸液中造血干/祖細(xì)胞的數(shù)量，對(duì)臨床血液病、惡性腫瘤、基因異常等疾病的造血干/祖細(xì)胞移植治療有十分重要的意義。13ppt課件

白血病的免疫分型

流式細(xì)胞術(shù)白血病免疫分型是利用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體作分子探針，多參數(shù)分析白血病細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿或細(xì)胞核的免疫表型，由此了解被測(cè)白血病細(xì)胞所屬細(xì)胞系列及其分化程度。FCM分析白血病免疫表型時(shí)，測(cè)量細(xì)胞數(shù)一般在10000～50000細(xì)胞之間，而且快速、特異、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，能區(qū)分細(xì)胞起源、劃分其分化發(fā)育階段等，對(duì)白血病的診斷與分型、治療方案選擇與預(yù)后判斷、發(fā)病機(jī)理研究等有重要價(jià)值。14ppt課件細(xì)胞系的鑒定新建細(xì)胞系新建立的細(xì)胞系，進(jìn)行系列的表型分析，以確定此細(xì)胞系的表型。已有細(xì)胞系的表型分析對(duì)于已知細(xì)胞系，由于多次傳代和培養(yǎng)條件的改變，細(xì)胞遺傳信息可能會(huì)發(fā)生突變，對(duì)其進(jìn)行表型分析，以檢測(cè)該細(xì)胞系是否有變異。15ppt課件3血小板功能分析與血小板病診斷

原理血小板是由骨髓巨核細(xì)胞產(chǎn)生的無(wú)核細(xì)胞，正常靜止?fàn)顟B(tài)呈兩面微凸的圓盤狀，平均直徑2～3μm。活化的血小板呈不規(guī)則形狀，表面有大量星狀突起，彼此間常發(fā)生粘附、聚集。血小板膜上有豐富的糖蛋白受體，是血小板發(fā)揮功能的分子基礎(chǔ)。16ppt課件

靜止與活化血小板膜糖蛋白分子的種類、含量、結(jié)構(gòu)、功能等顯著不同，一些血小板糖蛋白的分子缺陷常導(dǎo)致血小板止血功能的異常，某些糖蛋白分子在血小板膜上高表達(dá)又是血小板被活化的特異性分子標(biāo)志。當(dāng)血小板表面結(jié)合有自身抗體時(shí)常導(dǎo)致血小板減少。血小板的上述變化，通過(guò)用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，可以敏感、特異、快速的診斷血小板病。17ppt課件血小板檢測(cè)指標(biāo)：質(zhì)膜糖蛋白：CD41/CD61（gpⅡb/Ⅲa）、

CD42b(GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ)顆粒膜糖蛋白：CD62P、CD63、TSP?；罨篻pⅡb/Ⅲa復(fù)合物—活化早期標(biāo)志物

CD62P—活化后期的表面標(biāo)志血小板抗體（PAIgG）。網(wǎng)織血小板計(jì)數(shù)：常用染料為TO。18ppt課件

應(yīng)用血小板無(wú)力癥診斷：

CD41/CD61缺失或異常巨大血小板綜合征診斷：

CD42a/CD42b缺失免疫性血小板減少性紫癜診斷：

PAIgG

血栓前狀態(tài)與血栓性疾病診斷：血小板活化異常19ppt課件4紅細(xì)胞疾病診斷

網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)與應(yīng)用網(wǎng)織紅細(xì)胞是未完全成熟的紅細(xì)胞，胞漿中仍殘留有不同含量的RNA。RNA含量越高，網(wǎng)織紅細(xì)胞越幼稚，反之，則接近于成熟紅細(xì)胞。網(wǎng)織紅細(xì)胞是反映骨髓紅系造血的指針。用熒光染料噻唑橙(ThiazoleOrange，TO)可使活體網(wǎng)織紅細(xì)胞中RNA染色，用488nm激光激發(fā)后發(fā)射綠色熒光，F(xiàn)CM分析其熒光強(qiáng)度的大小可測(cè)量網(wǎng)織紅細(xì)胞的數(shù)量和RNA含量。主要用于貧血篩查。

睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)的診斷

紅細(xì)胞表面CD59缺失20ppt課件

5細(xì)胞內(nèi)蛋白的分析：

細(xì)胞破膜后將細(xì)胞內(nèi)某一蛋白成分進(jìn)行熒光標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)量分析，同表型分析一樣，可以測(cè)量出這種陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量和這種蛋白的相對(duì)含量。并且，結(jié)合細(xì)胞表型分析，進(jìn)行多標(biāo)記和多參數(shù)分析，可以檢測(cè)出含這種蛋白的細(xì)胞是屬于哪一種表型的細(xì)胞。多用間標(biāo)法，熒光探針多為FITC。也可以與周期分析結(jié)合起來(lái)，分別分析蛋白陽(yáng)性和蛋白陰性細(xì)胞的細(xì)胞周期，這在研究功能蛋白對(duì)周期的調(diào)控作用是非常有用的工具。21ppt課件6可溶性蛋白的檢測(cè)：

為最新發(fā)展起來(lái)的用于檢測(cè)可溶性蛋白的流式細(xì)胞技術(shù)(CBA)，是將待檢蛋白吸附到微球上，再與熒光探針結(jié)合，測(cè)定微球上這種蛋白的熒光強(qiáng)度，與已知微球的熒光強(qiáng)度相比較，求出待測(cè)蛋白的含量，分析軟件可自動(dòng)給出相關(guān)方程。22ppt課件7分選：

用熒光探針標(biāo)記的細(xì)胞，可被有效地分離出來(lái)，可用于分選的效率較高的儀器國(guó)內(nèi)較少，臺(tái)式機(jī)一般分選速度為每少鐘300個(gè)細(xì)胞，而大型機(jī)分選速度可達(dá)到每秒上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，并可做到點(diǎn)對(duì)點(diǎn)分選。但分選速度也與細(xì)胞中目的細(xì)胞的百分率及細(xì)胞懸液的密度有關(guān)。23ppt課件FCM的應(yīng)用，概括成一句話就是

凡是能被熒光素標(biāo)記的且這種熒光素能被流式細(xì)胞儀所配置的激光光源激發(fā)的細(xì)胞或顆粒，都可用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。在生物檢測(cè)技術(shù)中流式細(xì)胞儀是不可多得的一機(jī)多用的儀器。24ppt課件

縱觀歷史，幾乎沒(méi)有哪一門科學(xué)技術(shù)象流式細(xì)胞術(shù)這樣凝結(jié)了眾多不同學(xué)術(shù)背景、不同科研領(lǐng)域的科學(xué)家的心血。從流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)明、改進(jìn)，流式細(xì)胞儀的研制、革新，到今天的眾多應(yīng)用領(lǐng)域的拓展，每一步都是諸如生物學(xué)、生物技術(shù)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、電子工程學(xué)、流體力學(xué)、激光技術(shù)、高等數(shù)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)、有機(jī)化學(xué)和物理學(xué)等學(xué)科知識(shí)綜合運(yùn)用的結(jié)晶。25ppt課件

而現(xiàn)代流式細(xì)胞術(shù)，更是由于結(jié)合了單克隆抗體技術(shù)、定量細(xì)胞化學(xué)和定量熒光細(xì)胞化學(xué)的應(yīng)用，使其在生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)等眾多研究領(lǐng)域的應(yīng)用將會(huì)越來(lái)越廣泛。26ppt課件五、流式樣品的制備中應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題

㈠熒光素和抗體的選擇

⒈熒光素的選擇：現(xiàn)在國(guó)內(nèi)引進(jìn)的大多數(shù)流式細(xì)胞儀只裝有一個(gè)激光光源，即488nm光源，所以我們?cè)谶x擇熒光素時(shí)要選擇能被488nm激光激發(fā)的熒光素，常用的熒光素有：①測(cè)細(xì)胞DNA和RNA含量：PI、7-AAD。②測(cè)細(xì)胞蛋白、抗體或抗原：FITC、PE、Per-CP、PE-CY5、PerCP-CY5.5。③測(cè)細(xì)胞膜電位：Rho-123。④測(cè)鈣離子：Fluo-3。27ppt課件⒉抗體的選擇：一定要選擇商業(yè)化的流式用單克隆抗體，此類抗體在制備過(guò)程中有嚴(yán)格的質(zhì)控，非特異熒光弱。最好用直標(biāo)抗體，如果是用間標(biāo)抗體，二抗的選擇更應(yīng)嚴(yán)格。28ppt課件

㈡樣品的準(zhǔn)備

評(píng)價(jià)一個(gè)樣品制備的優(yōu)劣，可有三個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，即①細(xì)胞的密度，不能低于1×106/ml；②非特異熒光，不超過(guò)1％；③細(xì)胞碎片和聚集體，不能出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的團(tuán)塊。29ppt課件

流式細(xì)胞儀對(duì)一個(gè)樣品提供的結(jié)果是否可信，雖然與儀器操作者的水平有很大關(guān)系，但在很大程度上取決于樣品制備的優(yōu)劣。細(xì)胞密度太低，影響測(cè)試速度并造成測(cè)試參數(shù)調(diào)整的困難，尤其是在做DNA分析時(shí)，由于細(xì)胞太少，勢(shì)必要提高樣品的流速，人為地增大了G0/G1期的CV值，影響了結(jié)果的可靠性；非特異熒光強(qiáng)，則造成樣品結(jié)果的假陽(yáng)性；聚集體增多，尤其是肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞聚集體，可造成流式細(xì)胞儀進(jìn)樣針的阻塞，影響儀器的性能，碎片可干擾測(cè)試結(jié)果，造成結(jié)果分析的困難。30ppt課件31ppt課件

㈢樣品對(duì)照細(xì)胞的熒光有自發(fā)熒光、非特異熒光和特異熒光，并且流式細(xì)胞術(shù)提供的陽(yáng)性細(xì)胞百分比和熒光強(qiáng)度都是相對(duì)陰性細(xì)胞而言的，所以在樣品制備中樣品對(duì)照的設(shè)置至關(guān)重要。①在測(cè)DNA時(shí)，要設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，即不做任何干預(yù)的細(xì)胞對(duì)照。②在檢測(cè)細(xì)胞膜CD分子和細(xì)胞內(nèi)蛋白或細(xì)胞因子時(shí)，要設(shè)同型抗體對(duì)照，如果是雙標(biāo)記或三標(biāo)記檢測(cè)，還要設(shè)單標(biāo)記的陽(yáng)性對(duì)照。32ppt課件

六、流式樣品的制備：

⒈細(xì)胞DNA分析：用本法可測(cè)定細(xì)胞周期、細(xì)胞倍體和凋亡，在樣品制備中存在的問(wèn)題主要是細(xì)胞的聚集和碎片，建議在固定細(xì)胞時(shí)加入1.5%-3%小牛血清。

①培養(yǎng)的細(xì)胞系、體液中分離的有核細(xì)胞或分離的組織細(xì)胞約1×106，離心沉淀后用0.3ml含5%-10%小牛血清的PBS懸浮，移入1.5mlEP管中，加入0.7ml無(wú)水乙醇，置-20℃固定細(xì)胞24小時(shí)以上（用本法制備的細(xì)胞可在-20℃保存一周甚至更長(zhǎng)的時(shí)間）。33ppt課件②3000rpm離心細(xì)胞30秒，吸棄上清，用1mlPBS重懸細(xì)胞，再離心洗滌細(xì)胞一次，吸棄上清，沉淀細(xì)胞用100μl1mg/mlRNaseA懸浮，37℃30min以消化RNA，再加入400μl50μg/mlPI，置暗處10min后上機(jī)檢測(cè)。

③結(jié)果分析：流式報(bào)告中可給出G0/G1、S、G2/M各期細(xì)胞的百分比、凋亡百分比和細(xì)胞倍體。34ppt課件⒉細(xì)胞表面CD分子檢測(cè)（以小鼠脾細(xì)胞CD4、CD8為例）：

①小鼠脾臟用注射器芯輕輕研磨，過(guò)200目濾網(wǎng)，將細(xì)胞濾于含5%小牛血清的PBS中，吸取0.1ml（約1×106）置離心管中，加入CD4及CD8抗體（加入量參照供應(yīng)商的推薦量，一般抗體的加入量為1μg/1×106/0.1ml），室溫30min。35ppt課件②加入B-D分司生產(chǎn)的細(xì)胞裂解液2ml室溫裂解RBC15min，用PBS洗滌細(xì)胞兩次，吸棄上清，沉淀用0.5mlPBS懸浮，上機(jī)檢測(cè)；也可用4%多聚甲醛固定，4℃避光可保存至少24小時(shí)。流式報(bào)告中可給出陽(yáng)性細(xì)胞的百分比和熒光強(qiáng)度。注意兩點(diǎn)：①建議使用B-D公司的RBC裂解液。②離心后上清一定要吸，不能倒，離心速度控制在1500rpm左右。36ppt課件⒊細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子測(cè)定：用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子是當(dāng)前流式細(xì)胞術(shù)中一種較新的技術(shù)。在免疫反應(yīng)中，細(xì)胞因子擔(dān)當(dāng)了重要的角色。幾乎所有的細(xì)胞因子均可由各種不同類型的細(xì)胞在體外產(chǎn)生。但利用生物測(cè)定技術(shù)、酶標(biāo)法或PCR技術(shù)不能回答某一特定的細(xì)胞因子在體內(nèi)究竟是由哪種細(xì)胞產(chǎn)生的，即使將細(xì)胞分離制備出來(lái)，由于存在污染其它細(xì)胞的可能性，結(jié)果仍然缺乏可靠性。

37ppt課件

理想的測(cè)定技術(shù)應(yīng)使細(xì)胞因子的檢測(cè)能在可區(qū)分其表型的單細(xì)胞中進(jìn)行，胞內(nèi)細(xì)胞因子染色和流式細(xì)胞術(shù)則可滿足這些要求。即流式細(xì)胞術(shù)可同時(shí)回答某種細(xì)胞因子是來(lái)源于哪種細(xì)胞表型陽(yáng)性的細(xì)胞。樣品制備：①體外刺激誘導(dǎo)細(xì)胞使其產(chǎn)生細(xì)胞因子；②刺激同時(shí)加入Monensin（莫能菌素）以中斷胞內(nèi)細(xì)胞因子的運(yùn)輸，使新合成的細(xì)胞因子聚積在高爾基體。③固定細(xì)胞；④加入打孔劑使在細(xì)胞膜上造成許多小孔（打孔），從而使大分子的細(xì)胞因子抗體能透過(guò)膜；⑤熒光標(biāo)記。常用打孔劑有Saponin、Triton-X100。38ppt課件

4.胞漿內(nèi)蛋白的測(cè)定收集細(xì)胞（如果是含有紅細(xì)胞的有核細(xì)胞，則用裂解液去除紅細(xì)胞），用含5～10%的牛血清PBS懸浮，終濃度為70％的乙醇固定，固定后洗去酒精，沉淀細(xì)胞細(xì)胞用0.2％Triton-x100破膜15min，加入一抗（一定要加飽和量）室溫30分鐘，離心洗滌兩次，洗去未結(jié)合的一抗，再加入二抗，室溫30min，洗滌二次，重懸于0.5mlPBS中上機(jī)測(cè)試。要設(shè)不加一抗的陰性對(duì)照。也可以不必固定。用這種方法可測(cè)周期蛋白、凋亡蛋白、基因表達(dá)產(chǎn)物等。39ppt課件5細(xì)胞膜電位測(cè)定：

Rho-123是線粒體的特異性染料，細(xì)胞被染料染色后，可測(cè)出細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，其熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱與細(xì)胞膜電位的高低有關(guān)，可間接反映出細(xì)胞的功能。其方法如下：

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取1×106細(xì)胞用PBS洗一次，再用1mlPBS懸浮，加入2.5mMRho-1232μl，使其終濃度為5μM，室溫作用30min，作用畢，用PBS洗細(xì)胞二次，0.5mlPBS重懸細(xì)胞，上機(jī)測(cè)試。由于凋亡和死亡細(xì)胞線粒體受損，熒光較弱，而功能正常的細(xì)胞熒光較強(qiáng)。在流式報(bào)告中的直方圖中可出現(xiàn)兩個(gè)峰或一個(gè)峰。

Rho-123的另一個(gè)用途是用于研究腫瘤細(xì)胞的耐藥。41ppt課件

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細(xì)胞內(nèi)鈣離子測(cè)定以RPMI1640培養(yǎng)基配成濃度大約為1×106/ml的細(xì)胞懸液，每ml細(xì)胞懸液中加入終濃度為1－5μmol/mlFluo-3/AM，充分混勻，室溫避光作用60分鐘。以HEPES緩沖的Hank’s平衡鹽溶液（含10