HLA-B27篩查檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

HLAB27篩查檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程××醫(yī)院檢驗(yàn)科臨床免疫室作業(yè)指導(dǎo)書(shū)文件編號(hào):XXX生效日期：共頁(yè)第頁(yè)1.目的規(guī)范HLAB27檢測(cè)的操作程序，保證項(xiàng)目的正常開(kāi)展，使得測(cè)量數(shù)據(jù)和檢測(cè)結(jié)果具有良好的溯源性、準(zhǔn)確性和可靠性。2.原理HLAB27是Ⅰ型人類主要組織相容性抗原，在外周血主要表達(dá)在淋巴細(xì)胞表面。在流式細(xì)胞儀中，血液細(xì)胞在鞘液的包圍和約束下，形成單細(xì)胞懸液高速由流動(dòng)室噴嘴噴出，受激發(fā)光照射產(chǎn)生前向散射光(FSC)、側(cè)向散射光(SSC)和熒光信號(hào)。前向角散射光與被測(cè)細(xì)胞直徑的平方密切相關(guān)，反映細(xì)胞體積的大小。側(cè)向角散射光對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)及核膜的折射率更為敏感，可提供有關(guān)細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的信息。而通過(guò)對(duì)熒光信號(hào)的檢測(cè)和定量分析，可得到細(xì)胞表面HLAB27表達(dá)情況，從而判斷全血樣本HLAB27陰陽(yáng)性結(jié)果。常見(jiàn)的幾種試劑品牌采用的原理如下。BFITCBPE血中，與白細(xì)胞膜上相應(yīng)的抗原結(jié)合，經(jīng)過(guò)溶血、洗滌(和固定)等步驟后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析，測(cè)定HLAB7陰性而HLAB27陽(yáng)性細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度和所占的百分比。BHLABFITCCD白(PE)單克隆抗體試劑加入人類全血樣本中時(shí)，熒光素標(biāo)記的抗體將特異地和白細(xì)胞表面的抗原結(jié)合。經(jīng)染色的樣本先BDFACSTM溶血素處理，溶解樣本中的紅細(xì)胞，然后進(jìn)行洗滌和固定，最后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。CD3表面抗原結(jié)合，CD3抗體主要用于識(shí)別T淋巴細(xì)胞群，用于T淋巴細(xì)胞的圈門使用；PurifiedHLAB7抗體主要用于封閉細(xì)胞表面HLAB7抗原，降低假陽(yáng)性。PE細(xì)胞法)和IgG2aFITC／IgG1PE雙色同型對(duì)照(流式細(xì)胞法)兩種試劑，后者使用與前者相應(yīng)單克隆抗體亞型一致的免疫球蛋白，和樣本反應(yīng)時(shí)，與前者有著相同的非特異性結(jié)合水平，但是與相應(yīng)抗原無(wú)特異性的反應(yīng)。作為對(duì)照試劑，可以排除前者試劑中單克隆抗體與樣本的非特異性反應(yīng)，從而提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度。3.標(biāo)本要求EDTA管)。室溫保存的抗凝全血，可穩(wěn)定48h；染色固定后的樣本在2~8℃條件下可穩(wěn)定24h。4.試劑與儀器表所示流式細(xì)胞儀HLAB27檢測(cè)試劑一覽表(品牌A)試劑名稱品牌劑型規(guī)格保存條件單克隆抗體 液體 鈉2mg／mlBSA的PBS2~8℃A：甲酸配試劑液體70ml室溫溶血?jiǎng)〣：碳酸鈉等配試劑液體32ml碳酸鈉等室溫C：多聚甲醛配試劑液體14ml多聚甲醛室溫鞘液液體10L—室溫清洗液液體5L—室溫?zé)晒馕⑶蛞后w10ml—2~8℃定1個(gè)月。備注：具體成分詳見(jiàn)表所示流式細(xì)胞儀HLAB27檢測(cè)試劑一覽表。表所示流式細(xì)胞儀HLAB27檢測(cè)試劑一覽表(品牌B)抗HLAB27FITC／CD3PE10×FACS溶血素HLAB27校準(zhǔn)微球可用于50次檢測(cè)，置于1．5ml含有明膠和含有少于50％二甘醇和少于15％甲醛可用于10次校準(zhǔn)，存放于的10×BDFACS溶血素。在2~25℃下保存。使用時(shí)，用室溫(20~25℃)的 試劑級(jí)水進(jìn)行1∶10稀釋。稀釋后的的緩沖鹽溶液中。微球用試劑如果使用玻璃容器保存于室溫下，于設(shè)定HLAB27檢測(cè)kappa)，用于T淋巴細(xì)胞的檢測(cè)。2~8℃下保存。為1個(gè)月。8℃下保存。HLABFITCCDPerCP雙色抗體試劑和溶血素 LAB7PE雙色試劑(流式細(xì)胞法)、流式溶血?jiǎng)?使用前用蒸餾水做10倍稀釋，即溶血?jiǎng)谜麴s緩沖液。5.操作步驟5．1．1按照檢測(cè)要求，分別向已編好號(hào)的試管中加入20μl單克隆抗體和同型對(duì)照 (IgG2aFITC／IgG1PE)。分別向試管中加入混勻的100μl抗凝血?；靹?，避光，室溫孵育20~30min。溶血前確認(rèn)A／B／C管路充滿并能打出液體。上機(jī)測(cè)樣(測(cè)B27一定要至少洗一遍方可上機(jī)檢測(cè))。30μl試劑A。5．2．2對(duì)每個(gè)樣本管，使用新的微量移液器槍頭往每個(gè)試管底部小心加入50μl混合均室溫下(20~25℃)在暗處孵育15~20min。注意：在孵育過(guò)程中避免樣本被陽(yáng)光直接曝曬。在加樣的過(guò)程中應(yīng)認(rèn)真操作以避免樣本粘到試管壁上。如果全血樣本粘在試管壁上，那么將無(wú)法被試劑染色。5．2．3將10×FACS溶解液稀釋為1×；往每個(gè)試管內(nèi)加入2ml室溫的1×FACS溶解注意：避免細(xì)胞和溶解液過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的接觸，否則會(huì)造成白細(xì)胞的破壞。50μl的殘留液以避免打散沉淀物。低速充分渦旋試管使殘留液內(nèi)的沉淀物重新懸浮。速充分旋動(dòng)3s。在室溫下以200g離心5min；吸取上清液，試管內(nèi)保留大約50μl的殘留液以避免打散沉淀物。低速充分渦旋試管使殘留液內(nèi)的沉淀物重新懸浮。固定液已經(jīng)充分混勻；在采樣前，樣本已固定30min。此時(shí)細(xì)胞可以在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析了。在流式分析前，將試管帽蓋上或這覆蓋試管，在2~8℃避光保存。固定的細(xì)胞應(yīng)該在染色24h之內(nèi)進(jìn)行分析。在使用流式儀分析之前，低速充分旋動(dòng)細(xì)胞以減少細(xì)胞的聚集。溫。用室溫純化水進(jìn)釋至1×濃度，配制好的溶液在室溫條件下儲(chǔ)存，可穩(wěn)定1個(gè)月。中的抗體試劑于已做好標(biāo)記的流式管管底。將100μl已充分混勻的抗凝人外周全血加入試管底部。注意：避免操作中碰觸流式管壁，管壁上的血液樣本無(wú)法進(jìn)行染色，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。室溫放置的1×溶血素。漩渦混合器上輕輕振蕩5s，室溫(18~25℃)避光靜置孵育15min。室溫下300g離心5min，棄去上清。漩渦混合器上輕輕振蕩5s，加入2mlPBS溶液。室溫下300g離心5min，棄去上清。漩渦混合器上輕輕振蕩5s，加入0．5mlPBS，2h內(nèi)完成檢測(cè)。瓶和儀器質(zhì)控微球的批號(hào)信息。并在配套軟件中完成儀器和HLAB27校準(zhǔn)，待儀器和HLAB27校準(zhǔn)通過(guò)后，方可開(kāi)始樣本檢測(cè)。測(cè)模板)。CYTCD所示；再做HLAB27H柱狀圖中，讀取T淋巴細(xì)胞群(CD3＋)，顯示HLAB27所示。圖所示HLAB27柱狀圖照，標(biāo)記為1號(hào)。另一支試管中加入20μlHLAB27FITC／HLAB7PE雙色試劑，標(biāo)記為2號(hào)。5．4．1．2各吸取100μlEDTA抗凝靜脈血分別加入1號(hào)和2號(hào)試管底部(避免將血樣沾到試管壁上)。 (避免細(xì)胞和溶血素過(guò)長(zhǎng)時(shí)間接觸，否則會(huì)造成白細(xì)胞的破壞)。100μl，避免將管底的細(xì)胞沉淀懸起)，加入2ml磷酸鹽緩沖液，輕旋混勻，使管底細(xì)胞重新懸起，300g離心5min，棄去上清(使用移液器小心吸取上清，使剩余液體為50~100μl，避免將管底的細(xì)胞沉淀懸起)。h檢測(cè))或多聚甲醛溶液(樣本放置超過(guò)2h后檢測(cè))。HLABAuto板。左／右箭頭按鈕，切換到欲選擇的盤號(hào)，單擊孔位選擇Isotype在樣本盤上的位置。管在樣本盤上的位置(樣本下的所有試管的盤號(hào)自動(dòng)保持一致，更換任何試管的盤號(hào)，該樣本下其他試管會(huì)自動(dòng)更改為與其一致的盤號(hào))。選中工作單列表中待測(cè)樣本的起始試管Isotype試管(非常重要，自動(dòng)測(cè)試只識(shí)別工作單中起始試管以下的樣本)。開(kāi)始依次執(zhí)行樣本測(cè)定。轉(zhuǎn)回至1號(hào)位朝外，此時(shí)可安全打開(kāi)倉(cāng)門，取出試管或卸下樣本盤。檢測(cè)同時(shí)也可根據(jù)需要，調(diào)整報(bào)告中的設(shè)門位置，統(tǒng)計(jì)結(jié)果隨之更新。6.校準(zhǔn)常用方式為使用試劑／儀器對(duì)應(yīng)的質(zhì)控微球溶液對(duì)儀器系統(tǒng)校準(zhǔn)和電壓標(biāo)定。7.質(zhì)控開(kāi)機(jī)前使用HLAB27標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)微球校準(zhǔn)儀器，對(duì)于無(wú)廠家或第三方質(zhì)控品的項(xiàng)目可在不同儀器之間進(jìn)行比對(duì)。8.結(jié)果判斷一般結(jié)果判斷的流程都是通過(guò)設(shè)門圈定(T)淋巴細(xì)胞，然后根據(jù)門內(nèi)抗HLAB27的平均熒光強(qiáng)度，并與判別界值相比較，大于或等于則判定為HLAB27陽(yáng)性，小于則為HLA9.注意事項(xiàng)min9．3·試劑須避光保存，使用時(shí)試劑應(yīng)盡可能短地暴露于光線下，建議將試劑恢復(fù)至室溫 (20~25℃)。注意試劑盒上標(biāo)注的失效日期，過(guò)期后請(qǐng)勿再使用。9．4·HLAB27抗體和其他若干種HLAB抗原發(fā)生交叉反應(yīng)，最常見(jiàn)的是和HLAB7抗原反應(yīng)。HLAB7陽(yáng)性樣本在FITC檢測(cè)器中的LMF值，因此可能落在HLAB27陽(yáng)性樣本的范圍內(nèi)，導(dǎo)致假陽(yáng)性的結(jié)果。結(jié)果必須和其他臨床信息結(jié)合起來(lái)綜合考慮。10.臨床意義HLA復(fù)合體位于第6號(hào)染色體的短臂上，該區(qū)DNA片段長(zhǎng)度為3000~4000kb，占人體整個(gè)基因的1／3000，HLAB27是HLAⅠ類基因中B位點(diǎn)上的一個(gè)等位基因，與多種疾病具有相關(guān)性，尤其是強(qiáng)直性脊柱炎(