抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體（ANCA）檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(ANCA)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程××醫(yī)院檢驗(yàn)科臨床免疫室作業(yè)指導(dǎo)書文件編號(hào):XXX生效日期：共頁第頁1.目的規(guī)范檢測(cè)血清或血漿中抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(ANCA)的流程，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。2.原理間接免疫熒光法：將稀釋的血清與生物載片(反應(yīng)區(qū)內(nèi)固定有包被基質(zhì)的生物薄片)溫育，如果樣本是陽性的，特異性IgG、IgA和IgM抗體與相應(yīng)的核抗原結(jié)合。在第二次溫育時(shí)，熒光素標(biāo)記的抗人抗體與結(jié)合在生物基質(zhì)上的抗體反應(yīng)，形成熒光顯微鏡下所觀察到的特異性熒光模式。3.標(biāo)本要求3．2·樣品收到后立即分離血清，不能及時(shí)測(cè)定的血清應(yīng)于2~8℃保存。4.試劑與儀器5.操作步驟 (PBS)吐溫緩沖液；待測(cè)血清樣本用PBS吐溫緩沖液1∶10稀釋。5．2·加樣：將加樣板放在泡沫板上，將25μl稀釋后的血清樣本加至加樣板的每一反應(yīng)生氣泡。5．3·溫育：將生物載片有生物薄片的一面朝下，蓋在加樣板的凹槽里，室溫(18~25℃)5．4·沖洗：用盛于燒杯內(nèi)的PBS吐溫緩沖液沖洗載片，然后立即將生物載片浸入裝有PBS泡至少5min。5．5·加樣：將20μlFITC標(biāo)記的抗人IgG(熒光二抗)加至潔凈加樣板的反應(yīng)區(qū)上。5．6·第二次溫育：從洗杯中取出生物載片，用吸水紙擦去背面和邊緣的水分后，立即蓋在加樣板的凹槽里，室溫(18~25℃)溫育30min。5．8·封片：將蓋玻片直接放在泡沫板的凹槽里。滴加封片介質(zhì)至蓋玻片，每一反應(yīng)區(qū)約10μl。從洗杯中取出一張生物載片，用吸水紙擦干背面和邊緣的水分。將生物載片有生物薄片的一面朝下放在已準(zhǔn)備好的蓋玻片上。6.校準(zhǔn)定期對(duì)加樣槍和熒光顯微鏡進(jìn)行校準(zhǔn)。關(guān)鍵部件更換或者維修后也需校準(zhǔn)。7.質(zhì)控每批次的實(shí)驗(yàn)應(yīng)帶上陰性和弱陽性質(zhì)控物，滴度結(jié)果的在控規(guī)則：陰性質(zhì)控物必須陰性，陽性質(zhì)控物結(jié)果在上下1個(gè)滴度內(nèi)。8.結(jié)果判斷熒光模式：乙醇固定的粒細(xì)胞可區(qū)分出兩種相關(guān)的ANCA(表所示)。胞漿型抗粒細(xì)胞胞漿抗體(cANCA)顯示均勻分布在整個(gè)中性粒細(xì)胞漿中的顆粒型熒光，細(xì)胞核無熒光。主要靶抗原是中性粒細(xì)胞中嗜苯胺藍(lán)顆粒內(nèi)的蛋白酶3(PR3)。而核周型抗粒細(xì)胞胞漿抗體 (pANCA)在中性粒細(xì)胞核周顯示光滑的帶狀熒光。主要靶抗原有髓過氧化物酶(MPO)、粒細(xì)胞特異性彈性蛋白酶、乳鐵蛋白、溶菌酶等?？沟鞍酌?抗體在甲醇和乙醇固定的粒細(xì)胞顯示相同的特異性熒光模式。通?？筂PO抗體在甲醇固定粒細(xì)胞上顯示弱或無反應(yīng)。表所示ANCA結(jié)果判讀ANCA反應(yīng)性結(jié)果1∶10無熒光反應(yīng)滴度1∶10或更高血清中未檢出該抗體血清中檢出該核體注：以出現(xiàn)陽性核型的最高稀釋度作為檢測(cè)的結(jié)果。9.生物參考區(qū)間健康人血清或血漿中ANCA為陰性，滴度＜1∶10。10.性能參數(shù)血清檢測(cè)的結(jié)果顯示特異性熒光強(qiáng)度基本一致，陰性血清檢測(cè)的結(jié)果為陰性。10．3·批間差異：用特征性血清對(duì)不同批號(hào)的產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，陽性血清檢測(cè)的結(jié)果顯示特異性熒光強(qiáng)度基本一致，陰性血清檢測(cè)結(jié)果為陰性。11.臨床意義11．2·cANCA主要見于韋格納肉芽腫(WG)?；顒?dòng)性WG患者在病變尚未影響到呼吸系統(tǒng)時(shí)cANCA敏感性是65％，當(dāng)患者已出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)、腎臟損害時(shí)其敏感性達(dá)90％以上。少數(shù)尚未治療的活動(dòng)性WG患者cANCA陰性，但隨著病情的發(fā)展，cANCA終將轉(zhuǎn)為陽性。非活動(dòng)性WG仍有40％cANCA陽性。其他的壞死性血管炎可出現(xiàn)pANCA。11．3·pANCA在快速進(jìn)行性血管炎性腎炎、多動(dòng)脈炎、ChurgStranss綜合征陽性率70％，慢性自身免疫性肝炎陽性率80％。pANCA主要與多發(fā)性微動(dòng)脈炎相關(guān)。pANCA的效價(jià)與疾病的活動(dòng)性相關(guān)。11．4·潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病和