免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)酶免疫技術(shù)

教學(xué)目標(biāo)知識(shí)目標(biāo)1.熟練掌握：ELISA的基本原理（重難點(diǎn)）、方法類型。2.掌握：酶免疫分析技術(shù)的技術(shù)分類（重難點(diǎn)）、常用的酶及酶的底物、酶標(biāo)記抗體的方法、酶聯(lián)免疫測(cè)定的應(yīng)用、免疫印跡試驗(yàn)。3.了解斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)。能力目標(biāo)思政-素質(zhì)目標(biāo)免疫學(xué)思維質(zhì)控、生物安全、理論聯(lián)系實(shí)際、嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)1.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理、方法類型、應(yīng)用及注意事項(xiàng)。2.酶免疫分析技術(shù)的分類。3.常用的酶及酶的底物。4.其他酶免疫技術(shù)的基本原理及應(yīng)用。本章要點(diǎn)目錄一免疫標(biāo)記技術(shù)概述二酶標(biāo)志物的制備三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)三其他酶免疫技術(shù)用熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學(xué)(或生物)發(fā)光劑等作為追蹤物（或稱示蹤物），標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)；并借助于熒光顯微鏡，射線測(cè)量?jī)x，酶標(biāo)檢測(cè)儀，電子顯微鏡和發(fā)光免疫測(cè)定儀等精密儀器，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果直接鏡檢觀察或進(jìn)行自動(dòng)化測(cè)定；可以在細(xì)胞、亞細(xì)胞、超微結(jié)構(gòu)及分子水平上，對(duì)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行定性、定量和定位研究；一免疫標(biāo)記技術(shù)概述免疫標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展歷程酶免ELISA（Engvall，1971）放射免疫分析（Berson和Yalow，1960）免疫熒光分析（Coons，1941）金標(biāo)免疫分析（Faulk和Taylor，1971）化學(xué)發(fā)光免疫分析（Arakawa，1977）時(shí)間分辨熒光免疫分析（Soini和Hemmila，1979）電化學(xué)發(fā)光免疫分析（Leland，1990）液相芯片（美國(guó)Luminex公司，1997）AgAb*Ag-Ab*熒光免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)免疫組化技術(shù)特點(diǎn)分類酶免疫技術(shù)(ng)放射免疫技術(shù)(pg)熒光免疫技術(shù)免疫電鏡技術(shù)免疫膠體金技術(shù)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)高度靈敏、特異、快速，定性、定量、定位

酶免疫分析技術(shù)是以酶標(biāo)記抗原或抗體為主要試劑，檢測(cè)樣本中相應(yīng)的抗體或抗原。將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶催化底物的放大作用和高敏感性相結(jié)合的一種免疫檢測(cè)技術(shù)。酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測(cè)定均相非均相固相酶免疫測(cè)定液相酶免疫測(cè)定教學(xué)目標(biāo)知識(shí)目標(biāo)1.熟練掌握：ELISA的基本原理（重難點(diǎn)）、方法類型。2.掌握：酶免疫分析技術(shù)的技術(shù)分類（重難點(diǎn)）、常用的酶及酶的底物、酶標(biāo)記抗體的方法、酶聯(lián)免疫測(cè)定的應(yīng)用、免疫印跡試驗(yàn)。3.了解斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)。能力目標(biāo)思政-素質(zhì)目標(biāo)免疫學(xué)思維質(zhì)控、生物安全、理論聯(lián)系實(shí)際、嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)1.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理、方法類型、應(yīng)用及注意事項(xiàng)。2.酶免疫分析技術(shù)的分類。3.常用的酶及酶的底物。4.其他酶免疫技術(shù)的基本原理及應(yīng)用。本章要點(diǎn)目錄一免疫標(biāo)記技術(shù)概述二酶標(biāo)志物的制備三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)三其他酶免疫技術(shù)第一節(jié)酶標(biāo)志物的制備

一、常用的酶和底物標(biāo)記酶的條件：

1.活性高，純度高2.作用專一性強(qiáng)3.性質(zhì)穩(wěn)定，易與抗原或抗體偶聯(lián)4.測(cè)定方法簡(jiǎn)便易行、敏感、精確5.酶和底物對(duì)人體無(wú)害且價(jià)廉易得1.辣根過(guò)氧化物酶（HRP）

糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基）主酶與酶活性無(wú)關(guān)輔基是酶的活性中心RZ值越大純度越高RZ值與酶活性無(wú)關(guān)，酶活性單位比RZ值更為重要

ELISA中應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記用酶

常用酶HRP的底物

DH2+H2O2→→→D+2H2OHRP供氫體DH2習(xí)慣上被稱為底物，底物有多種。H2O2為受氫體，不穩(wěn)定，需在用前臨時(shí)配置。OPD反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，測(cè)定波長(zhǎng)492nm。不穩(wěn)定，致癌性。TMB反應(yīng)后顯藍(lán)色，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色,測(cè)定波長(zhǎng)450nm，穩(wěn)定，無(wú)致癌性，ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物。

HRP的常見底物

2.堿性磷酸酶

是一種磷酸酯水解酶，從大腸桿菌中提取。ALP底物

對(duì)-硝基苯磷酸酯（pNPP）經(jīng)AP作用后的產(chǎn)物為黃色對(duì)硝基酚，最大吸收峰波長(zhǎng)為405nm。二、制備酶標(biāo)記抗體(抗原）的方法制備酶標(biāo)記物的方法應(yīng)符合簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高，避免酶、抗體（抗原）、酶標(biāo)記物各自形成聚合物，標(biāo)記反應(yīng)不影響酶的活性和抗原抗體的免疫反應(yīng)性等原則。

主要方法：1.戊二醛交聯(lián)法

2.改良過(guò)碘酸鈉法

三、酶標(biāo)記物的純化與鑒定純化的方法較多，分離大分子混合物的方法均可應(yīng)用。常用的是凝膠層析法和硫酸銨鹽析法，硫酸銨鹽析法操作簡(jiǎn)便。酶標(biāo)記物的鑒定主要有：1、酶活性和抗體（抗原）免疫活性的鑒定

2、酶標(biāo)記率的測(cè)定

四、固相載體（一）固相載體的要求①結(jié)合抗體或抗原的容量大；②與抗原或抗體結(jié)合穩(wěn)定且不易脫落；③不影響所固定的抗體或抗原的活性；④固化方法應(yīng)簡(jiǎn)便、快速。

（二）固相載體的種類1．塑料制品由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形狀主要有微量反應(yīng)板、小試管和小珠三種。2．微粒微顆粒是由高分子單體聚合成的微球或顆粒。

3.膜載體是一種多孔薄膜過(guò)濾材料，包括硝酸纖維素膜（NC）、玻璃纖維素膜等。教學(xué)目標(biāo)知識(shí)目標(biāo)1.熟練掌握：ELISA的基本原理（重難點(diǎn)）、方法類型。2.掌握：酶免疫分析技術(shù)的技術(shù)分類（重難點(diǎn)）、常用的酶及酶的底物、酶標(biāo)記抗體的方法、酶聯(lián)免疫測(cè)定的應(yīng)用、免疫印跡試驗(yàn)。3.了解斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)。能力目標(biāo)思政-素質(zhì)目標(biāo)免疫學(xué)思維質(zhì)控、生物安全、理論聯(lián)系實(shí)際、嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)1.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理、方法類型、應(yīng)用及注意事項(xiàng)。2.酶免疫分析技術(shù)的分類。3.常用的酶及酶的底物。4.其他酶免疫技術(shù)的基本原理及應(yīng)用。本章要點(diǎn)目錄一免疫標(biāo)記技術(shù)概述二酶標(biāo)志物的制備三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)三其他酶免疫技術(shù)ELISA屬于免疫標(biāo)記技術(shù)的一種，1971年由荷蘭和瑞典的學(xué)者提出，由于其操作過(guò)程簡(jiǎn)單易行并可以定量，從而使其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，ELISA）第二節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA方法操作簡(jiǎn)單，測(cè)定模式多，應(yīng)用方便，亦可自動(dòng)化，但測(cè)定線性范圍較窄，批間變異相對(duì)較大，手工操作受影響因素較多，國(guó)內(nèi)多用在抗原和抗體的定性檢測(cè)，但也可用于定量檢測(cè)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定法和其他免疫方法一樣，都是以抗體和抗原的特異性結(jié)合為基礎(chǔ)，其差別在于酶聯(lián)免疫方法以酶或者輔酶作為標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記抗原或抗體，用酶促反應(yīng)的放大作用來(lái)顯示初級(jí)免疫學(xué)反應(yīng)。其最大的特點(diǎn)是利用聚苯乙烯微量反應(yīng)板（或球）吸附抗原或者抗體使之固相化，在其中進(jìn)行免疫反應(yīng)和酶促反應(yīng)。一、ELISA的檢測(cè)原理

將已知抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌的方法將固相上的抗原抗體復(fù)合物與液相中的游離成分分開。加入酶的底物后，通過(guò)酶對(duì)底物催化的顯色反應(yīng)程度，對(duì)標(biāo)本中抗原或抗體進(jìn)行定性或定量。待測(cè)樣品（含待測(cè)物）與酶標(biāo)抗原或抗體反應(yīng)洗滌的方法將固相載體上的復(fù)合物與其他物質(zhì)分離將抗原或抗體固定于合適的載體上，并保持其生物活性

使抗原或抗體與某種酶連接，形成酶標(biāo)抗原或抗體加入酶反應(yīng)底物，復(fù)合物上的酶催化底物使其分解，氧化或還原成有色產(chǎn)物1.包被2.抗原抗體反應(yīng)3.洗滌4.顯色ELISA基本原理二、ELISA的方法類型（一）雙抗體夾心法雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法，適用于檢測(cè)含有至少兩個(gè)抗原決定簇的較大分子抗原的測(cè)定。

E固相抗體標(biāo)本（含抗原）酶標(biāo)抗體EE底物如果血清標(biāo)本中含有類風(fēng)濕因子（RF），則可出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)。因?yàn)轭愶L(fēng)濕因子是一種抗變性IgG的自身抗體，它可同時(shí)與固相抗體和酶標(biāo)抗體的Fc段發(fā)生結(jié)合，導(dǎo)致假陽(yáng)性的出現(xiàn)。

（二）雙位點(diǎn)一步法測(cè)定抗原時(shí)，如應(yīng)用針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，則在測(cè)定時(shí)可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步。如果待檢標(biāo)本中抗原濃度過(guò)高，容易形成“鉤狀效應(yīng)（hookeffect）”。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)，可出現(xiàn)假陰性結(jié)果，必要時(shí)可將待檢標(biāo)本適當(dāng)稀釋后重新測(cè)定。

EEE底物固相抗體標(biāo)本（含抗原）酶標(biāo)抗體（三）間接法間接法是檢測(cè)抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（亦稱為酶標(biāo)二抗）來(lái)檢測(cè)已與固相結(jié)合的待測(cè)抗體。此法由于受血清中高濃度非特異性IgG的干擾，通常要將待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行一定稀釋后才能測(cè)定。

固相抗原標(biāo)本（含抗體）酶標(biāo)二抗底物EEE（四）競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法既可用于檢測(cè)抗原，也可用于檢測(cè)抗體。1.競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原待測(cè)抗原和酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與待測(cè)抗原的量呈反比，待測(cè)抗原越多，其結(jié)合特異性抗體越多，而酶標(biāo)抗原與特異性抗體結(jié)合就減少，底物顯色反應(yīng)淺；顯色越深，待測(cè)抗原量則越少。酶標(biāo)抗原

EEEE固相抗體標(biāo)本（含抗原）底物E競(jìng)爭(zhēng)法主要用于檢測(cè)小分子抗原，因小分子抗原只有一個(gè)抗原決定簇

。

2.競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)抗體HBcAb和HBeAb的測(cè)定均采用競(jìng)爭(zhēng)法，但其測(cè)定具體模式有區(qū)別。（1）競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)HBcAb：先將HBcAg包被在固相載體上，形成固相抗原，之后加入待測(cè)樣本和酶標(biāo)的特異抗體，待測(cè)樣本的抗體將與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相載體上的特異抗原結(jié)合，溫育后洗滌，加入酶底物顯色，顯色的強(qiáng)弱與待測(cè)抗體的含量成反比

。固相抗原標(biāo)本（含抗體）底物酶標(biāo)抗體EEEEE競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)HBcAb（2）競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)HBeAb：先將HBeAb包被在固相載體上，形成固相抗體，同時(shí)加入待測(cè)樣本和中和抗原HBeAg，待測(cè)樣本的抗體將與固相抗體競(jìng)爭(zhēng)與中和抗原HBeAg結(jié)合。加入酶標(biāo)的特異抗體，再加入酶底物，則顯色的強(qiáng)弱與待測(cè)樣本中的相應(yīng)抗體的含量成反比。固相抗體標(biāo)本（含抗體）抗原酶標(biāo)抗體EE底物E競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)HBeAb

(五)捕獲法固相載體上連接的是IgM的第二抗體，先將標(biāo)本中的IgM類抗體捕獲，然后再分別加入特異抗原和酶標(biāo)抗體（動(dòng)物源性IgG），形成抗人IgM-IgM-特異抗原-酶標(biāo)抗體的復(fù)合物，復(fù)合物含量與待測(cè)IgM成正相關(guān)。最后加入底物，依據(jù)顯色程度來(lái)確定待測(cè)血清中IgM的含量。

固相抗人lgM抗體E標(biāo)本（含抗體）抗原底物EE捕獲法檢測(cè)lgM抗體在應(yīng)用此法時(shí)需注意RF(IgM類)及其他非特異IgM的干擾。RF(IgM類)既能與固相載體上的IgM第二抗體結(jié)合，又能與隨后加入的酶標(biāo)抗體結(jié)合，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。(六)雙抗原夾心法將已知抗原包被在固相載體上，待測(cè)標(biāo)本中的相應(yīng)抗體可分別與固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合，形成固相抗原-抗體-酶標(biāo)抗原的復(fù)合物，加入底物后依據(jù)顯色程度來(lái)確定待測(cè)抗體的含量。

E固相抗原標(biāo)本（含抗體）酶標(biāo)抗原底物EE三、ELISA的關(guān)鍵技術(shù)（一）各種試劑的制備1．抗原和抗體2．包被與封閉

包被(coating)是將抗原或抗體固定在固相載體上的過(guò)程。封閉(blocking)就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。

3．酶標(biāo)結(jié)合物的制備

（二）最適工作濃度的選擇各類血清抗原稀釋度1：501：1001：2001：4001：800強(qiáng)陽(yáng)性1.201.040.840.680.42弱陽(yáng)性0.640.410.300.220.19陰性0.230.130.080.060.05稀釋液0..080.020.020.020.04間接法測(cè)抗體中包被抗原最適工作濃度的選擇

（三）測(cè)定方法的標(biāo)準(zhǔn)化

1．加樣應(yīng)力求準(zhǔn)確，并注意不可產(chǎn)生氣泡。2．溫育注意反應(yīng)的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定的要求，整塊反應(yīng)板的溫度應(yīng)一致。3．洗滌

洗滌有手工洗滌和洗板機(jī)洗滌兩種方法，若用洗板機(jī)洗滌要適當(dāng)增加洗滌次數(shù)。4．顯色要控制好顯色時(shí)間。四、評(píng)價(jià)與應(yīng)用（一）評(píng)價(jià)ELISA的方法具有高度的特異性和靈敏度，操作方便快速，試劑穩(wěn)定，對(duì)環(huán)境無(wú)污染，儀器、設(shè)備要求簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)結(jié)果既可以用肉眼觀察作定性分析，也可以用酶標(biāo)儀進(jìn)行定性、定量分析，已經(jīng)成為臨床免疫檢驗(yàn)中的常用技術(shù)。（二）應(yīng)用1.病原微生物測(cè)定2.激素測(cè)定3.藥物測(cè)定4.腫瘤標(biāo)志物5.蛋白質(zhì)測(cè)定教學(xué)目標(biāo)知識(shí)目標(biāo)1.熟練掌握：ELISA的基本原理（重難點(diǎn)）、方法類型。2.掌握：酶免疫分析技術(shù)的技術(shù)分類（重難點(diǎn)）、常用的酶及酶的底物、酶標(biāo)記抗體的方法、酶聯(lián)免疫測(cè)定的應(yīng)用、免疫印跡試驗(yàn)。3.了解斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)。能力目標(biāo)思政-素質(zhì)目標(biāo)免疫學(xué)思維質(zhì)控、生物安全、理論聯(lián)系實(shí)際、嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)1.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理、方法類型、應(yīng)用及注意事項(xiàng)。2.酶免疫分析技術(shù)的分類。3.常用的酶及酶的底物。4.其他酶免疫技術(shù)的基本原理及應(yīng)用。本章要點(diǎn)目錄一免疫標(biāo)記技術(shù)概述二酶標(biāo)志物的制備三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)三其他酶免疫技術(shù)第三節(jié)其他酶免疫技術(shù)一、均相酶免疫技術(shù)

（一）酶擴(kuò)大免疫分析技術(shù)（二）克隆酶供體免疫分析酶擴(kuò)大免疫分析技術(shù)示意圖克隆酶供體免疫分析示意圖

液相酶免疫技術(shù)是非均相酶免疫技術(shù)的方法類型之一，因抗原抗