造血干細(xì)胞的生物學(xué)課件

造血干細(xì)胞的生物學(xué)

一、造血干細(xì)胞的增殖和分化造血干細(xì)胞（hematopoieticstemcell,HSC）是各種白細(xì)胞和免疫細(xì)胞的始祖，擔(dān)負(fù)極其重要的生理功能。

具有三個重要特征：①高度自我更新或自我復(fù)制的能力；②多向分化潛能；③絕大多數(shù)可長期維持在非增殖狀態(tài)，這些特征隨著干細(xì)胞的分化逐漸減弱和消逝。1造血干細(xì)胞的生物學(xué)

一、造血干細(xì)胞的增殖和分化HSC的自我更新及分化增殖受眾多的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)，包括干細(xì)胞因子（SCF）、血小板生成素（TPO）、紅細(xì)胞生成素（EPO）、白細(xì)胞介素11（IL-11）、粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）及趨化因子等多種因子。

2造血干細(xì)胞的特征和識別

造血干細(xì)胞沒有明確的形態(tài)學(xué)特征，形態(tài)上都表現(xiàn)為淋巴樣的單個核母細(xì)胞，這就給干細(xì)胞從形態(tài)的識別和檢測帶來了困難。但從干細(xì)胞的功能及細(xì)胞表面抗原的表達上則為造血干細(xì)胞的識別和分離提供了條件。

3造血干細(xì)胞的特征和識別（一）功能的角度，可用細(xì)胞培養(yǎng)方法在體外觀察細(xì)胞發(fā)育潛能

集落形成單位（CFU）

4造血干細(xì)胞的特征和識別X

（一）功能的角度，可用細(xì)胞培養(yǎng)方法在體外觀察細(xì)胞發(fā)育的潛能，1、脾集落形成單位（CFU-S）

是較早期的造血干細(xì)胞，具有形成紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、巨核細(xì)胞或混合多種造血細(xì)胞的多向分化能力。2、髓系多向祖細(xì)胞集落（CFU-GEMM）是檢測可以生成紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和巨核細(xì)胞的祖細(xì)胞，它具有一定的自我復(fù)制能力，有向不同細(xì)胞學(xué)分化的能力，具有造血干細(xì)胞的部分功能。3、長期培養(yǎng)起始細(xì)胞（LTC-IC），是指那些經(jīng)5-8周培養(yǎng)后仍能生成單向或多向性祖細(xì)胞群的造血細(xì)胞，比較接近多能干細(xì)胞，這種檢測方法是近幾年實驗和臨床研究中國的較多、較可靠的干細(xì)胞檢測方法。上述檢測和實驗的方法都不能直接識別單個干細(xì)胞。

5造血干細(xì)胞的特征和識別

（二）細(xì)胞表面抗原表達及其單克隆抗體1、CD34+細(xì)胞為具有造血重建能力的人造血干細(xì)胞，2、CD34+

、Thy－1low、Lin-為造血干細(xì)胞特征，其中Thy為胸腺細(xì)胞表面抗原標(biāo)記，Lin為特定細(xì)胞系的系列標(biāo)記，如果表達陽性，那么它就成為已分化的細(xì)胞。3、CD34+

、CD33-、Lin-、HLA―DR-代表造血干細(xì)胞，其中HLA―DR與細(xì)胞的增殖有關(guān)，而干細(xì)胞常處在非增殖狀態(tài)，因此干細(xì)胞應(yīng)不表達HLA―DR。64、CD34+

、Lin-、Sca-1+

、C―Kit+

細(xì)胞屬多能造血干細(xì)胞。5、AC133是一個新的造血干細(xì)胞標(biāo)記，AC133特異在造血干細(xì)胞和早期祖細(xì)胞上表達，6、近幾年實驗研究發(fā)現(xiàn)CD34-造血細(xì)胞比CD34+造血細(xì)胞更為原始，它能分化為CD34+細(xì)胞并進一步向髓系和淋巴系發(fā)育。

7CD34+細(xì)胞選擇法親和柱層析，分離和免疫磁珠法。通過特異性識別、俘獲及洗脫分離得到CD34+細(xì)胞。（1）親和柱層析:將預(yù)分選的細(xì)胞與生物素化（biotinglated）的抗CD34抗原的單抗一起孵育，然后洗去未結(jié)合的抗體，通過抗生物素蛋白包被的聚丙酰胺柱的親和柱，使CD34+細(xì)胞留滯在柱內(nèi)的聚丙酰胺表面上，再經(jīng)機械搖動，沖洗出CD34+細(xì)胞。

8（2）免疫磁珠分離法

CD34單抗標(biāo)記細(xì)胞后，與超順磁性微球連接、通過強磁場中的過濾柱時，陽性細(xì)胞被吸附，陰性細(xì)胞被濾掉。研制出了納米微粒作為固相收集CD34+細(xì)胞。通過將采集物與抗CD34抗原的單抗結(jié)合，細(xì)胞特異地被超順磁鐵－葡聚糖納米（直徑50nm）微球結(jié)合，使CD34+細(xì)胞與納米微球形成復(fù)合物，再通過磁鐵誘導(dǎo)的強磁場過濾柱，分離出CD34+細(xì)胞。其CD34+細(xì)胞回收純度＞95％,回收率67%以上。9

造血干細(xì)胞（HSC）主要來源于骨髓、成人外周血、臍血臍血來源干細(xì)胞的特點CD34＋細(xì)胞數(shù)低于骨髓，但CD34＋CD38-細(xì)胞數(shù)高于骨髓，且臍血CD34＋CD38-細(xì)胞增殖分化能力高于骨髓，尤其是加入各種細(xì)胞因子后CFU-GEMM（多向祖細(xì)胞）、BFU-E（紅系祖細(xì)胞）集落數(shù)明顯高于骨髓。淋巴系統(tǒng)抗原表達弱，淋巴細(xì)胞功能不成熟，這顯示出臍血干細(xì)胞移植(UCBT)后移植物抗宿主病(GVHD)的發(fā)生率可能較低。研究表明凍存10年的臍血HSC仍具有良好的回收率。10

造血干細(xì)胞的可塑性

造血干細(xì)胞不僅能重建造血細(xì)胞,而且能分化心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、消化道上皮細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞等。

另外：骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在恰當(dāng)?shù)拇碳は履苻D(zhuǎn)化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、星形細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、心肌細(xì)胞等細(xì)胞。骨髓多能前體細(xì)胞,其表達胚胎干細(xì)胞的遺傳標(biāo)志,體外培養(yǎng)條件類似于胚胎干細(xì)胞,且能高度擴增;在體外它不僅能分化成基質(zhì)細(xì)胞,而且能分化為內(nèi)臟中胚層、神經(jīng)外胚層細(xì)胞和肝細(xì)胞等內(nèi)胚層細(xì)胞。

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干細(xì)胞的可塑性

對造血系統(tǒng)被破壞的小鼠進行肌細(xì)胞移植后,小鼠造血功能恢復(fù),是由于肌肉組織內(nèi)的造血干細(xì)胞的作用引起.■

肝損害的小鼠進行骨髓移植后,肝臟再生的原因是骨髓中的卵圓細(xì)胞在肝內(nèi)轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞.12

干細(xì)胞可塑性機制干細(xì)胞可以經(jīng)歷轉(zhuǎn)分化的過程,細(xì)胞的基因信息可以重組,經(jīng)過基因重組,細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)化為多種不同的細(xì)胞.

如從視網(wǎng)膜神經(jīng)中提取少突膠質(zhì)細(xì)胞,在體外無血清,低密度的培養(yǎng)條件下,獲得神經(jīng)干細(xì)胞的功能和特征.細(xì)胞融合是最近對干細(xì)胞可塑性的又一種解釋.

如將小鼠骨髓干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞,或小鼠神經(jīng)干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞共培養(yǎng)后,獲得的融合細(xì)胞表現(xiàn)胚胎干細(xì)胞的功能和特征.

13造血干細(xì)胞移植及在腫瘤治療中的應(yīng)用

HematopoieticStemCellTransplantationinCancerThearpy

造血干細(xì)胞移植（hematopoieticstemcelltransplantation;HSCT）的概念

是經(jīng)大劑量放、化療或其他免疫抑制劑進行預(yù)處理，清除受者體內(nèi)的病理細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞、異常克隆細(xì)胞、病態(tài)造血細(xì)胞）或阻斷發(fā)病機制，然后把異體或自體的造血干細(xì)胞移植到受者體內(nèi)，以重建受者的正常造血及免疫功能，達到治療疾病目的的治療手段。14造血干細(xì)胞移植概況

自1993年以來，自體外周血干細(xì)胞移植（autologousperipheralbloodstemcelltransplantation;APBSCT）的數(shù)量超過了自體骨髓移植（ABMT）。近幾年，隨著對臍血研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)人類臍血中含有大量的造血干/祖細(xì)胞，其中淋巴細(xì)胞抗原性弱，功能相對不成熟，移植后發(fā)生急性移植物抗宿主?。℅VHD）的危險性低等，已成為造血干細(xì)胞移植的又一方法，即臍血干細(xì)胞移植（cordbloodstemcelltransplantation,CBSCT）。15造血干細(xì)胞移植種類及特點

一、移植種類（一）根據(jù)造血干細(xì)胞來源分類

1、骨髓移植（bonemarrowtransplantation,BMT）.

2、外周血干細(xì)胞（peripheralbloodstemcelltransplantation,PBSCT）。

3、臍血干細(xì)胞移植（cordbloodstemcelltransplantation,CBSCT）。（二）根據(jù)供者來源不同分類

1、同基因造血干細(xì)胞移植（syngeneicHSCT,syn–HSCT）。

2、異基因造血干細(xì)胞移植（allogeneicHSCT,allo–HSCT）。

3、自體造血干細(xì)胞移植（autologousHSCT,AHSCT）.

16造血干細(xì)胞移植種類及特點（三）二者結(jié)合分類

1、同基因骨髓移植（Syn–BMT）

2、同基因外周血干細(xì)胞移植（Syn–PBSCT）

3、異基因骨髓移植（allo–BMT）

4、異基因外周血干細(xì)胞移植（allo–PBSCT）

5、自體骨髓移植（ABMT）

6、自體外周血干細(xì)胞移植（APBSCT）

7、臍血干細(xì)胞移植（CBSCT）（四）根據(jù)預(yù)處理強度分

1、清髓性異基因造血干細(xì)胞移植

2、非清髓性異基因造血干細(xì)胞移植

17造血干細(xì)胞移植種類及特點二、各類造血干細(xì)胞移植特點（一）同基因造血干細(xì)胞移植

1、供者為同卵孿生同胞，不存在HLA（humanleukocyteantigen）差異。

2、易于植入，不存在排斥及移植物抗宿主?。℅VHD），亦無移植物抗白血病效應(yīng)（GVL）。

3、不需進行移植細(xì)胞的體外凈化。

4、移植并發(fā)癥較少，安全性高，移植費用較低。

5、移植后惡性疾病復(fù)發(fā)率較異基因造血干細(xì)胞移植為高。

6、移植適應(yīng)癥較廣泛。

18造血干細(xì)胞移植種類及特點（二）異基因造血干細(xì)胞移植

1、需要有HLA相同的同胞或非血緣關(guān)系志愿者作為供者，理論上同胞兄妹間有1/4的機會相配，非同胞兄妹間約1/10萬-1/20萬。

2、供受者之間存在不同程度的免疫學(xué)差異，移植后可發(fā)生排斥反應(yīng)及移植抗宿主反應(yīng)GVHD。

3、供者干細(xì)胞為正常細(xì)胞，移植適應(yīng)癥廣泛。

194、移植物中無殘留病變細(xì)胞，不需體外凈化，移植后有抗白血病效應(yīng)，因而移植療效確切，腫瘤性疾病的復(fù)發(fā)率低，效果最好。

5、移植相關(guān)并發(fā)癥、死亡率較高，移植費用較高。

6、移植成活后，因GVHD的影響，生存質(zhì)量較自體移植差。

20造血干細(xì)胞移植種類及特點（三）自體造血干細(xì)胞移植AHSCT

1、供者為患者本人，不受供髓來源限制。

2、是否適宜進行AHSCT，受患者自身病情限制，移植適應(yīng)癥較窄。

3、因移植物中可能有殘留病變細(xì)胞，移植后病情復(fù)發(fā)率較高。

4、需考慮進行體外凈化處理移植物，以改善療效。

5、移植相關(guān)并發(fā)癥、相關(guān)死亡率較低，適宜移植患者的年齡范圍較大，移植費用較低。

6、無GVHD，移植成功后生存質(zhì)量較好。21造血干細(xì)胞移植種類及特點（四）外周血干細(xì)胞移植

1、外周血中造血干細(xì)胞收集比較方便，用血細(xì)胞分離機進行分離、采集，采集方法可重復(fù)，供體無需麻醉，可免于多部位骨髓穿刺的痛苦和不便，供者易于接受。

2、因從外周血進行造血干細(xì)胞的采集，對骨髓有浸潤纖維化或接受過骨盆放療的患者仍可施行。

3、正常情況下外周血干細(xì)胞含量很少，需進行動員處理方可有效增加外周血干細(xì)胞含量，以供移植時采集。

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4、與骨髓相比，外周血中腫瘤細(xì)胞混入可能較少，自體移植后外周血移植復(fù)發(fā)率可能低于自體骨髓移植。

5、外周血干細(xì)胞移植PBSCT后造血功能重建快，免疫功能恢復(fù)早，感染出血并發(fā)癥低且輕，降低了移植相關(guān)死亡率，縮短了住院時間。

6、PBSCT時，因外周血干細(xì)胞中存在大量T淋巴細(xì)胞，可能增加GVHD的發(fā)生率或加重GVHD的程度。

23造血干細(xì)胞移植種類及特點（五）臍血造血干細(xì)胞移植

1、臍血干細(xì)胞來源廣泛，采集方便，作為造血干細(xì)胞容易獲得，但需凍存保存，保存條件要求高，規(guī)模要求大，需相當(dāng)投資規(guī)模的臍血庫來進行保存。

2、臍血淋巴細(xì)胞抗原性弱，免疫功能不成熟，臍血干細(xì)胞移植后GVHD的發(fā)生率及嚴(yán)重程度較低。因此，對HLA配型的要求和嚴(yán)格程度低于骨髓移植。

3、造血重建較慢。

4、單份臍血量較少（約50-150ml），造血干細(xì)胞數(shù)量有限，目前臨床上主要用于兒童或低體重成年人，大體重成年人的廣泛應(yīng)用仍在探索中。

24造血干細(xì)胞移植種類及特點（六）非清髓性異基因造血干細(xì)胞移植（nonmyeloablativeallogeneicstemcelltransplantation）

1、處理（放/化療）劑量低。

2、預(yù)處理減弱同時加強免疫抑制用藥。

3、移植后造血常呈供受者兩種血細(xì)胞的混合嵌合狀態(tài)。

25造血干細(xì)胞移植的適應(yīng)癥X一、異基因造血干細(xì)胞移植適應(yīng)癥（一）腫瘤性疾病

1、急性白血病為allo-HSCT的主要適應(yīng)癥，移植時機以在初次完全緩解期進行，效果為好，但兒童ALL標(biāo)危型和AMLM3型可能通過化療獲得良好的效果，一般主張在第二次緩解或早期復(fù)發(fā)的時候進行。

2、慢性粒細(xì)胞性白血病allo-HSCT是目前可以根治CML的惟一手段，年齡越輕，療效越好，對45歲以下患者應(yīng)盡早做，確診后17個月內(nèi)行HSCT，效果優(yōu)于17個月后行HSCT。加速期或急變期的療效差，成功率低。

26異基因造血干細(xì)胞移植適應(yīng)癥X

（一）腫瘤性疾病

3、骨髓增生異常綜合征主要用于幼稚細(xì)胞比例較高或有復(fù)雜染色體異位的患者。allo-HSCT治療可使患者3年無病生存率接近50%，相當(dāng)一部分可獲根治，尤其年輕患者，早期移植者療效佳。

4、惡性淋巴瘤對高危型、難治性、多發(fā)性或骨髓被累及者宜行allo-HSCT。

5、多發(fā)性骨髓瘤早期治療效果優(yōu)于晚期治療，allo-HSCT不能使MM患者已發(fā)生的骨質(zhì)損害恢復(fù)正常。

6、實體瘤：乳腺癌、卵巢癌、小細(xì)胞肺癌等。27異基因造血干細(xì)胞移植適應(yīng)癥X（二）非腫瘤性疾病

1、重癥再生障礙性貧血為非腫瘤性疾病中接受BMT最多的疾病，未輸血前行allo-HSCT治療效果明顯好于輸血后行allo-HSCT。

2、免疫缺陷病包括重癥聯(lián)合免疫缺陷?。ㄟz傳性）、自體免疫性疾病。

3、遺傳代謝病包括范可尼綜合征、高雪病、尼曼–匹克病。

4、珠蛋白生成障礙性貧血allo-HSCT可使患者無病長期存活率達70%~90%，對無脾大或門脈纖維化的患者，效果尤佳。但是本病為慢性疾病，對癥治療可使患者生存相當(dāng)長的時間，allo-HSCT有一定的近期病死率及遠期并發(fā)癥，是否做移植要權(quán)衡利弊。

5、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿、急性放射病等。

28自體造血干細(xì)胞移植適應(yīng)癥

X（一）惡性血液病

1、急性白血病，一般應(yīng)在初次完全緩解后并進行3~4個療程鞏固化療后進行。

2、慢性粒細(xì)胞白血病，AHSCT對慢性粒細(xì)胞性白血病的療效差，很難消除Ph1染色體陽性克隆，復(fù)發(fā)率高，一般不主張做。有學(xué)者研究用經(jīng)過補體長期培養(yǎng)及分選技術(shù)分選出的ph1（‐）細(xì)胞做AHSCT，似有發(fā)展前景。

3、霍奇金病，對經(jīng)過3~4個常規(guī)療程化療仍未能獲得CR患者或取得CR后復(fù)發(fā)者宜進行AHSCT。

4、非霍奇金淋巴瘤（NHL），低惡度NHL病情急變者，中高惡度NHL，首次治療達CR后鞏固強化治療或僅達部分緩解（PR）者及常規(guī)化療取得CR后又復(fù)發(fā)的患者均是AHSCT的適應(yīng)癥。

惡性淋巴瘤是AHSCT的最好適應(yīng)癥，是AHSCT做得最多的病例。

29自體造血干細(xì)胞移植適應(yīng)癥X

（一）惡性血液病

5、多發(fā)性骨髓瘤（MM），由于MM患者年齡多偏大，常規(guī)治療MM有效率較低，因此MM成為AHSCT較好的適應(yīng)癥。

6、慢性淋巴細(xì)胞白血癥（CLL），對于常規(guī)治療效果不佳的進展性的CLL，AHSCT是其有效的選擇。

7、原發(fā)性巨球蛋白血癥（WM），對于常規(guī)化療效果不佳的難治性或進展性的WM，AHSCT可能有很好的效果。（我們的1例難治性、進展期WM，常規(guī)治療無效時行APBSCT，4年后仍處于CR中。）

30自體造血干細(xì)胞移植適應(yīng)癥X（二）實體瘤

1、乳腺癌：AHSCT對轉(zhuǎn)移性或難治局灶性乳腺癌顯示了較好的療效，乳腺癌是目前AHSCT最多的疾病之一。

初治的Ⅲ、Ⅳ期及炎性乳腺癌在常規(guī)誘導(dǎo)化療達CR或PR者，復(fù)發(fā)乳腺癌對常規(guī)誘導(dǎo)化療方案敏感者，Ⅱ期病人腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移6個以上及有其他不良預(yù)后因素者。

2、卵巢癌，AHSCT治療卵巢癌是一種可望延生其生存期的有效治療手段。用于手術(shù)及化療失敗、復(fù)發(fā)或難治的患者。

3、小細(xì)胞肺癌：小細(xì)胞肺癌惡性程度高，易早期發(fā)生血性轉(zhuǎn)移，是肺癌癥發(fā)展最迅猛的一種，對放化療高度敏感。AHSCT可以提高有效率和生存率。

4、其他：神經(jīng)母細(xì)胞瘤、Ewing肉瘤、惡性黑色素瘤等。（三）非惡性疾病

自體免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、原發(fā)性血小板減少性紫癜、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥等都有移植有效的報道。

31造血干細(xì)胞移植相關(guān)技術(shù)一、造血干細(xì)胞采集目前用于移植的造血干細(xì)胞主要來源于骨髓、外周血和臍帶血。不同來源的造血干細(xì)胞其采集方式不同。

32骨髓的采集1、骨髓采集的條件（1）自體：①前提：血液系統(tǒng)惡性疾患已取得完全緩解或?qū)嶓w瘤尚未累及骨髓；

②身體條件適宜做自身造血干細(xì)胞移植，有移植適應(yīng)癥，無移植禁忌癥；③麻醉危險相關(guān)的檢查，無麻醉禁（2）異體：①年齡：親屬供者年齡一般8-55歲；②身體條件：身體健康，無急、慢性傳染性疾病，無特殊家族史及遺傳病史，HLA配型適合；③知情同意。

33骨髓的采集2、骨髓采集的準(zhǔn)備

（1）術(shù)前體檢，了解自體或異體供者的身體狀況，進行術(shù)前評估，確無禁忌方可采髓。

（2）自體循環(huán)備血，移植時所采集的骨髓是骨髓液與血液的混合液。采髓過程中根據(jù)采髓量的多少會有明顯的失血。因此必須進行采髓前自體循環(huán)采血備血，以備采髓時回輸補充血容量。

34骨髓的采集3、骨髓采集方法骨髓的采集必須在潔凈手術(shù)室內(nèi)進行，整個過程應(yīng)保持無菌。麻醉由麻醉師主持與操作，采用硬膜外麻醉。在髂后及髂前上棘行多點穿刺抽吸，每個點在多方向、多層次上進行抽吸，每次抽取4~6ml骨髓液。采集的骨髓予含有肝素的滅菌MPI1640或TC199保養(yǎng)液進行抗凝保養(yǎng)，每100ml保養(yǎng)液加肝素4000單位，慶大霉素2000單位，1ml保養(yǎng)液可抗凝3~8ml骨髓液。35骨髓的采集每次采集的骨髓量根據(jù)具體情況不同而不同，自體骨髓采集細(xì)胞數(shù)為有核細(xì)胞數(shù)1×108/kg體重，若采出的骨髓要進行體外凈化處理，則需3×108/kg體重以上。異體骨髓采集細(xì)胞數(shù)為有核細(xì)胞數(shù)達3×108/kg體重。采出的骨髓液中含有骨髓小粒須經(jīng)100目金屬網(wǎng)過濾，最后裝袋，做好標(biāo)記，保持無菌?；颊咴陂_始采髓時即給予輸血，在采髓的整個過程中應(yīng)注意輸血及靜脈足量輸液，予生理鹽水和膠體溶液交替輸入。采髓結(jié)束后，采髓局部應(yīng)嚴(yán)密消毒，無菌紗布加壓包扎，壓迫止血?；颊呋夭》亢竺芮杏^察術(shù)后反應(yīng)，連續(xù)給予抗生素3天預(yù)防感染。364、骨髓采集并發(fā)癥

骨髓采集基本是安全的，術(shù)后反應(yīng)以局部疼痛最常見，少數(shù)患者可發(fā)熱，偶有與麻醉有關(guān)的嚴(yán)重并發(fā)癥（術(shù)后肺炎、心律不齊）或局部感染。

37外周血干細(xì)胞的動員與采集

1、外周血干細(xì)胞的動員正常狀態(tài)下，外周血中的干/祖細(xì)胞含量較低，占單個核細(xì)胞的0.01%~0.1%。在化療后骨髓抑制的恢復(fù)早期，細(xì)胞因子的作用下可有大量的干/祖細(xì)胞由骨髓進入到外周血，使外周血在短期內(nèi)存在有大量的干/祖細(xì)胞。此時采集可得到供造血干細(xì)胞移植用的足量的造血干/祖細(xì)胞。

38外周血干細(xì)胞的動員與采集動員方法

外周血干細(xì)胞動員的方式有三種，即大劑量化療，單用造血生長因子，化療加造血生長因子。①單用造血生長因子：a、G-CSF：5~10ug/kg.d皮下注射，5~7天。一般大多數(shù)供者在G-CSF5ug/kg.d×5天情況下，可使外周血細(xì)胞數(shù)量明顯增加有足夠的干/祖細(xì)胞供移植時采集，且有量效關(guān)系；b、GM-CSF：5~10ug/kg.d皮下注射7~10天。GM-CSF較G-SF的動員作用稍差，付作用較G-CSF大；c、G-CSF+GM-CSF與單用G-CSF相比無明顯優(yōu)點。

39外周血干細(xì)胞的動員與采集②單純使用化療動員：a、大劑量環(huán)磷酰胺：大劑量環(huán)磷酰胺是大劑量單一藥物進行動員的代表。4~7g/m2的劑量被廣泛認(rèn)可而采用b、大劑量足葉乙甙（VP16）及馬法蘭也是單一藥物動員中報道較多的藥，VP16可用至2g/m2，馬法蘭可用至140mg/m2；c、聯(lián)合化療的動員：很多的資料顯示聯(lián)合化療作為動員外周血干細(xì)胞的方法是確切可行的，只要化療強度足夠能達到骨髓的抑制，就可能成功的動員外周血干細(xì)胞。動員方案因疾病的不同可為不同的聯(lián)合化療方案。

40外周血干細(xì)胞的動員與采集③化療加G-CSF聯(lián)合動員：化療加G-CSF聯(lián)合動員外周血干細(xì)胞已是較為成熟的動員方法，有很多的應(yīng)用報道。本動員方法較單用化療或G-CSF效果更好，且兼顧了原發(fā)病的治療。41外周血干細(xì)胞PBSC的動員與采集（2）影響PBSC動員效果的因素①年齡：在同樣動員方案及藥物劑量下，動員效果與年齡呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。②動員方法：化療加G-CSF的動員效果較單純化療或G-CSF動員效果好。③藥物劑量：化療的劑量、骨髓抑制的程度和白細(xì)胞恢復(fù)的速度均與動員效果呈正相關(guān)關(guān)系。G-CSF、GM-CSF的劑量與動員效果亦呈正相關(guān)關(guān)系。④動員前的治療情況：動員前化療次數(shù)過多、強度過強，距前一次化療時間過近，均可影響動員效果。既往化療中使用了包括卡氮芥和馬法蘭在內(nèi)的烷化劑類藥物，且劑量過強易使造血干細(xì)胞嚴(yán)重受損而影響動員效果。

42外周血干細(xì)胞的動員與采集（3）外周血干細(xì)胞動員的并發(fā)癥及副反應(yīng)①含有化療動員方案的動員因在用藥后多有白細(xì)胞和血小板的明顯減少，故感染和出血為其主要的并發(fā)癥。②含有造血生長因子動員方案的動員?？砂l(fā)生骨痛，以腰骶部和骨盆部的酸、脹、痛為突出，嚴(yán)重時呈全身骨痛，尤以健康供者表現(xiàn)突出。還可有胸膜滲出物，血管神經(jīng)水腫和發(fā)熱。使用GM-CSF時，常有發(fā)熱及流感樣癥狀，這些副反應(yīng)均隨著藥物的停用而很快消失。無遠期不良反應(yīng)。

43外周血干細(xì)胞的動員與采集（4）外周血干細(xì)胞的采集時機①異體造血干細(xì)胞移植的動員以單純細(xì)胞生長因子進行,多在第5、6天時CD34+細(xì)胞達峰值，因而多在動員第5、第6天時采集。②自體造血干細(xì)胞移植的動員以化療加細(xì)胞生長因子動員為主，CD34+細(xì)胞峰值在白細(xì)胞快速回升時達峰值，最佳時機是白細(xì)胞快速回升至5×109/L左右時。③動態(tài)監(jiān)測CD34+細(xì)胞比值的變化，以CD34+細(xì)胞值作采集標(biāo)準(zhǔn)，不論異體外周血干細(xì)胞移植還是自體外周血干細(xì)胞移植，一旦CD34+細(xì)胞>1%即可采集。

44外周血干細(xì)胞的動員與采集X（5）外周血干細(xì)胞的采集方法①設(shè)備：采集外周血干細(xì)胞用血細(xì)胞分離機②采集：用血細(xì)胞分離機對血液進行大量的體外循環(huán)處理，血流速度為30~80ml/分，一般處理3倍以上人體血容量（約12L），絕大部分可在一次采夠移植所需細(xì)胞數(shù)。一次采不夠可以在第2天重復(fù)進行，若2次仍采不夠可進行3次。③外周血干細(xì)胞采集量：a、異體外周血干細(xì)胞，單個核細(xì)胞數(shù)為5~8×108/kg體重，CD34+細(xì)胞數(shù)為2~5×106/kg體重，CFU-GM數(shù)為2~5×105/kg體重；b、自體外周血干細(xì)胞：單個核細(xì)胞數(shù)為2~5×108/kg體重，CD34+細(xì)胞數(shù)為>2×106/kg體重，CFU-GM數(shù)為>2×105/kg體重。④影響外周血干細(xì)胞采集的因素：a、動員效果不佳；b、采集時機不當(dāng)；c、采血通路與返血通路不通暢；d、體外循環(huán)血量不足。

45造血干細(xì)胞保存和回輸

（一）造血干細(xì)胞的保存造血干細(xì)胞保存是造血干細(xì)胞治療技術(shù)的重要組成部分，現(xiàn)己廣泛用于臨床。主要用于自體造血干細(xì)胞移植，臍血干細(xì)胞的保存及移植，基因治療、免疫治療等方面。造血干細(xì)胞的保存分為

(1)非冷凍保存

(2)冷凍保存

46造血干細(xì)胞保存和回輸

1、非冷凍保存（1）保存方法非冷凍保存最主要的保存方式是4℃冰箱保存。將經(jīng)肝素抗凝采集的，含有1/3組織培養(yǎng)液MPI1640或TC199保養(yǎng)液的骨髓或細(xì)胞濃度為5×107/ml以下。細(xì)胞在4℃保存不同時間后細(xì)胞回收率結(jié)果在各個實驗室有差異。但總的情況是：細(xì)胞在4℃保存24h其細(xì)胞數(shù)及活率基本是穩(wěn)定的，保存3-4天后一般下降為原來的50-80%。目前在臨床應(yīng)用4℃保存的造血干細(xì)胞進行造血干細(xì)胞移植時，一般均選擇在72h以內(nèi)回輸。實踐證明，4℃保存72h內(nèi)的造血干細(xì)胞進行自體移植，移植后病人造血均能順利重建。

47造血干細(xì)胞保存和回輸

1、非冷凍保存（2）保存特點1、不需要特殊設(shè)備，簡便易行，在基層醫(yī)院均可進行。2、細(xì)胞不經(jīng)冷凍過程，無冷凍損傷，回輸后造血恢復(fù)快。3、細(xì)胞液中不含冷凍保存液，回輸時無相關(guān)副作用。4、保存時間短，應(yīng)用受限，僅適用于預(yù)處理方案時間短的造血干細(xì)胞移植情況。48造血干細(xì)胞保存和回輸

2、冷凍保存冷凍保存即零下溫度保存，是將造血干細(xì)胞降溫到零下某一溫度，使細(xì)胞代謝停止后保存于零下溫度.這是造血干細(xì)胞安全可靠的保存方式，可使造血干細(xì)胞長久保存。目前廣泛使用的方法有三種。

49造血干細(xì)胞保存和回輸

（1）程控降溫凍存：造血干細(xì)胞（骨髓需先進行冷凍前的分離、濃縮處理）在自體血漿或血漿蛋白濃度為5%保護液中，細(xì)胞終濃度在3×107~8×108/ml之間，然后緩慢加入冷凍保護劑二甲基亞砜（DMSO），終濃度為10%，分裝于冷藏袋內(nèi)。在程控降溫儀內(nèi)以每分鐘1℃~2℃的降溫速度進行降溫處理，當(dāng)被凍存細(xì)胞降溫到-50℃時，則以每分鐘下降5℃的速度繼續(xù)降溫，當(dāng)凍存細(xì)胞溫度達-80℃后，即放入液氮中（-196℃）長期保存。程控降溫冷凍是最安全可靠的造血干細(xì)胞長期保存方法。但所需設(shè)備價格昂貴，冷凍耗時過長。

50造血干細(xì)胞保存和回輸（2）非程控降溫冷凍保存造血干細(xì)胞不通過程控降溫直接冷凍保存于-80℃冰箱的方法，稱為非程控降溫冷凍保存。該方法是將造血干細(xì)胞（分離、濃縮的骨髓、臍血或外周血干細(xì)胞）用5%的DMSO+6%羥乙基淀粉（HES）+4%人血清蛋白做為保護劑，調(diào)整細(xì)胞終濃度1~4×108/ml分裝于冷藏袋內(nèi)，直接放入-80℃冰箱里冷凍保存。這種方法是較簡單可靠的方法，且易進行重復(fù)操作。但凍存時間不如程控降溫冷凍保存時間長。

51造血干細(xì)胞保存和回輸（二）冷凍造血干細(xì)胞的解凍和回輸解凍是低溫保存造血干細(xì)胞的最后步驟，此過程易引起細(xì)胞腫脹、破裂死亡。合理的解凍方法是快速復(fù)溫解凍，快速復(fù)溫可縮短細(xì)胞解凍腫脹過程，并可避免重結(jié)晶現(xiàn)象的發(fā)生，盡可能的減少此過程中的細(xì)胞破壞。解凍方法一般是采用37℃~42℃水浴解凍熔化細(xì)胞。解凍熔化的細(xì)胞須在10分鐘之內(nèi)回輸，在回輸解凍的細(xì)胞時，要注意DMSO所致的不良反應(yīng)，如：頭痛、惡心、嘔吐、血尿、低血壓等。輸注前患者要抗過敏、抗休克等預(yù)防處理。

52造血干細(xì)胞的凈化

（一）體外凈化的方法1、物理學(xué)方法：①細(xì)胞密度梯度法；②細(xì)胞電泳法；③細(xì)胞滲透性休克法；④細(xì)胞冷凍法；⑤高熱殺傷法；⑥光敏法53造血干細(xì)胞的凈化（一）體外凈化的方法2、藥理學(xué)方法：①環(huán)磷酰胺衍生物：A、4-HC（4-羥環(huán)磷酰胺的類似物）；B、ASTA-Z（mafosfamide）；②VP-16（足葉乙甙）；③博萊霉素；④長春新堿；⑤高三尖杉酯堿；⑥烷基溶磷脂（ALP）；⑦阿糖鳥嘌呤（Ara-G）

54造血干細(xì)胞的凈化（一）體外凈化的方法3、免疫學(xué)方法：①單克隆抗體+補體；②免疫膠體鈷法；③免疫毒素法；④抗體軛化療藥物；⑤抗體軛放射核素；⑥LAK細(xì)胞法；⑦免疫吸附法；⑧免疫磁珠法；⑨補體溶解法；⑩流式激活細(xì)胞分選法

55造血干細(xì)胞的凈化（一）體外凈化的方法4、生物學(xué)方法；①長期液體培養(yǎng)法；②胎肝低分子抑瘤物5、分子生物學(xué)方法：①反義寡核苷酸法；②自殺基因轉(zhuǎn)染法

56造血干細(xì)胞的凈化（二）負(fù)凈化與正凈化及特點負(fù)凈化（陰性選擇）即用不同的方法清除造血干細(xì)胞中所含腫瘤細(xì)胞而保留正常的造血細(xì)胞的方法。這種方法的特點是：①特異性較差，對正常造血細(xì)胞的損傷較明顯；②移植后造血和免疫功能的重建較慢，并發(fā)癥發(fā)生機會增加；③凈化效應(yīng)有限，移植后的復(fù)發(fā)率較高；④部分方法簡便、易操作，無需特殊設(shè)備。57正凈化（陽性選擇）即利用正常造血干/祖細(xì)胞與許多腫瘤細(xì)胞表達CD34+抗原的差異，將CD34+的正常造血細(xì)胞從造血移植物中分離出來的方法。這種方法的特點是：①避免了細(xì)胞毒性藥物和免疫毒素凈化時可能對正常造血干細(xì)胞的損傷；②無需進行抗腫瘤抗體凈化的多環(huán)節(jié)體外處理，減少污染機會；③不會因腫瘤細(xì)胞對細(xì)胞毒性藥物和免疫毒素的敏感性差異而影響凈化效應(yīng)；④移植后造血和免疫功能恢復(fù)較快；⑤凈化效應(yīng)較好，移植后復(fù)發(fā)率有所改善。

58造血干細(xì)胞移植的預(yù)處理

預(yù)處理是在回輸造血干細(xì)胞前對患者進行的一個療程大劑量化療和/或大劑量放療。其目的和意義主要在于：①清除體內(nèi)的惡性細(xì)胞或骨髓中的異常細(xì)胞群，以達到治療疾病的目的；②為移植的造血干細(xì)胞準(zhǔn)備空間，以利移植的造血干細(xì)胞定植；③抑制或摧毀受者的免疫細(xì)胞和功能，使造血干細(xì)胞不被排斥，容易植活