Westernblot標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)

10Westernblot標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)【原理】〔或酶ELISA法外，也可用與檢測DNARNA相類似的吸印方法。前兩法有“南”和“北”之意，故本法遂被延長稱為Western〔西〕印跡法，該法能用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分出與專一抗血135I-A或辣根過氧化物酶連接的山羊抗IgG檢測已6小時(shí)或過夜。蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS與某一復(fù)原劑并用，并通過加熱使蛋白質(zhì)解離后再加樣于電泳凝SDSSDS的量幾乎SDS多肽復(fù)合物在聚丙烯酰1.4SDSpHSDS多肽復(fù)合物向前推動。樣品通過高度多孔性的積層膠后，復(fù)合物在分別膠外表聚攏成一條很薄的區(qū)帶〔或稱積層〕。曲于SDS聚丙烯酰胺凝膠的區(qū)分率。最廣泛使用的不連續(xù)緩沖系統(tǒng)最早是由Ornsstein(1964)和Davis(1964)設(shè)計(jì)的，樣品和積層膠中含Tris-Cl(pH6.8)，上下槽緩沖液含Tris-甘氨酸(pH8.3)，分別膠中含Tris-Cl(pH8.8)0.1％的SDS(Laemmli,1970)樣品和積層膠中的氯離干形成移動界面的先導(dǎo)邊界而甘氨酸分子則組成跟隨邊界pH面中解脫后，SDSpH并被篩分而依各自的大小得到分別。【常用試劑】1〕30%丙烯酰胺/0.8%N,N’-亞甲丙烯酰胺300.8N,N’-60ml的水中，加熱37℃溶解之，補(bǔ)加水至終體積為100ml。0.45μm微孔濾膜過濾除菌，查證該pH7.0，置棕色瓶中保存。N,N’-亞甲丙烯酰胺時(shí)應(yīng)戴手套和面具。可認(rèn)為聚丙烯酰胺無毒，但也應(yīng)慎重操作，由于它還可能含有少量未聚合材料。2〕4×Tris?Cl/SDS,pH8.8,300mlH2O91gTris堿(1.5mol/L)1mol/LpH8.8,HO500ml0.45um2gSDS[0.4%(w/v)1月。3〕4×Tris?Cl/SDS,pH6.8,6.8,H2O100ml。用0.45um0.4gSDS[0.4%(w/v)]，于41月。4〕4×SDS電泳緩沖液Trisbase24.2gGlycerin115.3g20%SDS20ml1000ml。應(yīng)用時(shí)稀釋4倍即為1×SDS電泳緩沖液(Tris0.05M,Glycerin0.38M,SDS0.1%)。5〕TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)TEMEDN,N’-亞甲丙烯酰胺的聚合。6〕10%過硫酸銨10%(w/v)4℃。由于過硫酸銨會緩慢分解，故應(yīng)隔周穎配制?！静襟E】0.75mm墊片組裝電泳裝置中的玻璃平板夾層，并固定在灌膠支架上。7.110％的過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌混勻。7.1聚丙烯酰胺分別膠的配制試劑成分配制不同濃度分別膠所需試劑(ml)5%8%10%12%15%Acry:Bis(30:0.8)2.504.005.006.007.504×Tris?Cl/SDS,pH8.83.753.753.753.753.75H2O8.757.256.255.253.7510%0.050.050.050.050.05TEMED0.010.010.010.010.01按所需分別的蛋白質(zhì)分子大小選擇適宜的丙烯酰胺百分比濃度，一般地，5％的凝膠可用于60～200kDa的SDS變性蛋白質(zhì)分子的分別，10％用于16～70kDa，15％用于12～45kDa。3〕用一根巴斯德吸管馬上將分別膠液體沿夾層中一條墊片的邊緣參加于玻璃平板夾層中，至凝膠約5cm高為止。樣品體積少于10μl不需灌制積層膠。用另一根已斯德吸管，先從一邊的墊片，再從另一邊墊片往夾層的液面頂部緩緩參加一層水飽和異丁醇〔1cm〕30min。TEMED，或兩者都有。1×Tris-Cl/SDS,pH8.8緩沖液沖洗凝膠的頂部外表,盡量用吸水紙吸干。至夾層的頂部。7.2聚丙烯酰胺積層膠的配制GEL%〔3.9%)Total(10.05ml)Acry:Bis(30:0.8)1.30ml4×Tris?Cl/SDS,pH6.82.50mlH2O6.10ml10%過硫酸銨0.05mlTEMED0.01ml將0.75mm30min。在具螺口蓋的微量離心管中，用2×SDS加樣緩沖液按1:1(v/v)稀釋待測蛋白質(zhì)樣品，于100℃煮沸5-10min。如樣品是蛋白質(zhì)沉淀物，參加50～100μl1×SDS1005-10min2×SDS加樣緩沖液溶解蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)混合物。0.3cm20μl法顯跡，成分很簡單的蛋白質(zhì)混合物需加25～50μg，而樣品中只有一種或不多的1～10μg10～100〔按樣品的簡單程度在小于20μl的體積溶有0.01～0.5ng蛋白樣品不等。2×SDS加樣緩沖液(loadingbuffer)配制：成 分體積(ml)0.5MTris?Cl(pH6.8)12.520%SDS11.5Glycerin102%Blue-Bromo-phenol2.5β-mercaptoethanol*5.0H2O50ml，分裝*β-mercaptoethanol在臨用前參加。9〕留神拔出梳子，避開撕裂聚丙烯酰胺凝膠加樣孔。取出梳子后，以1×SDS電泳電泳緩沖液沖洗加祥孔，并以此緩沖液布滿之。10〕按廠商指南將凝膠板固定到電泳裝置的上緩沖液室〔上槽〕，同時(shí)往下緩沖液室〔下槽〕參加推舉量的1×SDS電泳緩沖液。11〕將固定于上槽的凝膠板放入下槽中，并往上槽參加局部電泳緩沖液至剛好漂浮凝膠的加樣孔。12〕50μl注射器將同樣濃度的蛋白質(zhì)樣品等體積參加到樣品孔1×SDS樣品緩沖液，以防相鄰泳道樣品的集中。13)1×SDS電泳緩沖液。此操作緩慢留神，以防沖起樣品孔中的樣品。連接電源，對于0.75mm厚的垂直板電泳，先在60V下電泳至溴酚藍(lán)染料從120V連續(xù)電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部為止。取出。16〕將凝膠定位以便識別加樣的挨次，將凝膠板從上槽解離出來，放在一疊吸水紙或紙巾上。17〕留神將封邊的墊片抽出一半，并以此為杠桿橇起上面的玻璃平板，使凝膠暴露出來。18〕留神從下面的玻璃平板上移出凝膠，在凝膠的一角切去一小塊以便在染色及干膠后仍能認(rèn)出加樣次序，接著就可進(jìn)展蛋白質(zhì)的檢測。轉(zhuǎn)膜〔100V，1小時(shí)要放于4℃。Fortransferofproteinssmallerthan20kDa,transferproteinsfromgeltoPVDF(polyvinylidenedifluoride)membraneat1Ampconstantcurrentfor45minsorequivalent(250mAmpfor3hoursor500mAmpfor90minutes)intransferbuffer(25mMTris,190mMglycine,20%MeOH).Fortransferofproteinssmallerthan120kDa,transferproteinsfromgeltoPVDFmembraneat1Ampconstantcurrentfor1hourorequivalent(250mAmpfor4hoursor500mAmpfor2hours)intransferbuffer(25mMTris,190mMglycine,20%MeOH).Forproteinslargerthan120kDa,transfertoPVDFmembraneat1Ampconstantcurrentfor90minutesorequivalent(250mAmpfor6hoursor500mAmpfor3hours)intransferbuffer+SDS(25mMTris,190mMglycine,20%MeOH,0.05%SDS).ForProteinslargerthan250kDa,transfertoPVDFmembraneat1Ampconstantcurrentfor1hourand45minutesorequivalent(500mAmpfor3.5hours)intransferbuffer+SDS(25mMTris,190mMglycine,20%MeOH,0.05%SDS).Addtransfer(orCAPS)buffertothetransferunitaccordingtomanufacturer1sdirections.Transferovernightwithasettingof20V/40mAorfor3hoursat70V/160mA.Thetransferprocessneedstotakeplaceundercoldtemperaturestopreventthegelfromstickingtothemembrane.Thiscanbeaccomplishedeitherbyusingawatercoolingcoreinthetransferunitorplacingtheentireunitat4?.Pleasefollowthemanufacturer1srecommendations、清洗1XTBST3次，每次5〔這步忘了！〕、封閉Removetheblotfromthetransferapparatusorstainingtrayandimmediatelyplaceintoblockingbuffer(1%BSA,10mMTrispH7.5,100mMNaCl,0.1%Tween20).Incubatetheblotfor1hourat37℃,2hoursatroomtemperature,orovernightat4℃.、一抗孵育TBST1:1000稀釋，將硝酸纖維素膜放入其中，371.5小時(shí)，(或4℃過夜)搖床搖動。ProbewithprimaryantibodyinTTBS/1%NFDMfor1hr.atroomtemperature.Primaryantibodyshouldbedilutedasspecifiedonproductdatasheets.Ifthesevaluesarenotavailable,usethefollowingguidelinesforinitialexperiments:applyantiseraorascitesat1:500to1:5,000,applypurifiedprimaryantibodiesataconcentrationof1ug/ml.、清洗1XTBST35分鐘。、二抗孵育TBST1:8000稀釋，將硝酸纖維素膜放入其中，371小時(shí)，搖床搖動。、清洗22，之后，用1XTBS2次，每次5分鐘，以洗去膜上的Tween20，由于它可以阻礙底物的沉積。、顯色按如下配方配制顯色液：1mL水+1滴〔50微升〕A(之后混勻)+1B+1C將硝酸纖維素膜放入其中孵育，一旦顯色，馬上放入去離子水中終止反響。Considerations:Perhapsthemostcommonprobleminwesternblottingistheoccurrenceofbackgroundstaining.Thebestremedyforhighbackground(inmanycases)issimplytodilutetheprimaryantibodyfurther.Othersolutionsincludeensuringthatdetergentisusedintheblockingreagent,usinganalternateblockingreagent(casaminoacids,BSA,serum),anddecreasingtheamountofproteinappliedtotheelectrophoresisgel.Occurrencesofextrabandsintheblotcanberesolvedbyseveralstrategies.Runacontrolblotomittingtheprimaryantibodytodetermineifthesecondaryantibodyisthesourceoftheproblem.Replacingthesecondaryantibodywithadifferentlotorasimilarreagentfromadifferentsourcecanprovideresolution.Spuriousbandsbelowthetargetedmolecularweightsuggestthattheproteinisbeingdegradedintheexperiment;inclusionofproteaseinhibitorscanhelp.Noorlowsignalcanberemediedbyloadingmoreproteininthegelorincreasingtheamountofprimaryand/orsecondaryantibodyappliedtootheblot. Someantibodieswillnotbindinthepresenceofdetergent;consultthedatasheetforeachantibodypriortoperforminganyprocedureWestern印跡法探針檢測之。Western使用的探針是抗體，它與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反響。這種技術(shù)的作用是對非放射性標(biāo)記蛋白組成的簡單混合物中的某些特異蛋白進(jìn)展鑒別和鑒定。儀器：高壓鍋、玻璃勻漿器、高速離心機(jī)、分光光度儀、—20℃低溫冰箱、垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置、恒溫水浴搖床、多用脫色搖床。試劑：單去污劑裂解液、0.01mol/LPBS(pH7.3)、10％分別膠、4％濃縮校、泳緩沖液、轉(zhuǎn)移緩沖液、10X麗春紅染液、封閉液、TBST、TBS、洗脫抗體緩沖液、顯影液、定影液、抗體、化學(xué)發(fā)光試劑。雜品與耗材：各種規(guī)格的吸頭、離心管和加樣器；各種規(guī)格的燒杯、量筒和平皿〔>20×20cm〕，X-光片夾，X-光片，玻棒長短各一根，計(jì)時(shí)器，吸水紙，試劑配制：〔一〕母液1.0mol/LTris?HClTris(MW121.14) 30.29g蒸餾水 200ml溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH〔見下所示250ml，高溫滅菌后室溫下保存。PH HCl17ml16m15ml8.0 10ml1.74mg/ml(10mmol/L)PMSFPMSF 0.174g異丙醇 100ml1.5ml離心管中，－20℃保存。0.2mol/LNaH2PO4NaH2PO4〔MW119.98〕 12g蒸餾水至 500ml溶解后，高壓滅菌，室溫保存。0.2mol/LNa2HPO4Na2HPO412H2O〔MW358.14〕71.6g蒸餾水至 1000ml溶解后，高壓滅菌，室溫保存。10％SDSSDS 10g蒸餾水至 100ml50℃水浴下溶解，室溫保存。如在長期保存中消滅沉淀，水浴溶化后，仍可使用。10％過硫酸胺〔AP〕過硫酸胺 0.1g超純水 1.0ml溶解后，41周。1.5mol/LTris?HCl〔pH8.8〕Tris(MW121.14) 45.43g超純水 200mlpH8.8250ml，高溫滅菌后室溫下保存。0.5mol/LTris?HCl〔pH6.8〕Tris(MW121.14) 15.14g超純水 200mlpH6.8250ml，高溫滅菌后室溫下保存。40％Acr/Bic〔37.5：1〕丙稀酰胺〔Acr〕 37.5g甲叉雙丙稀酰胺〔Bic〕 1g超純水至 100ml37℃下溶解后，4℃保存。使用時(shí)恢復(fù)至室溫且無沉淀。20％Tween20Tween20 20ml蒸餾水至 100ml4℃保存?！捕呈褂靡簡稳ノ蹌┝呀庖骸?0mmol/LTris?HClpH8.0，150mmol/LNaCl，1％TritonX－100，100?g/mlPMSF〕：1mol/LTris?HCl〔pH8.0〕2.5mlNaCl 0.438gTritonX－100 0.5ml蒸餾水至 50ml混勻后，4℃保存。使用時(shí)，參加PMSF100?g/ml〔0.87ml裂解液PMSF50μl〕。0.01mol/LPBS〔pH7.2-7.4〕0.2mol/LNaH2PO4 19ml0.2mol/LNa2HPO4 81mlNaCl 17g蒸餾水至 2023mlG250考馬斯亮藍(lán)溶液〔測蛋白含量專用〕考馬斯亮藍(lán)G250：100mg95％乙醇： 50ml磷酸： 100ml蒸餾水至 1000ml4℃保存。0.15mol/LNaClNaCl〔MW58.44〕0.877g蒸餾水至 100ml高溫滅菌后，室溫保存。100mg/ml牛血清白蛋白〔BSA〕BSA 0.1g0.15mol/LNaCl 1ml溶解后，－200.15mol/LNaCl100倍1mg/ml，－20℃保存。104％濃縮校塊膠，5ml〕

10％分別〔兩塊膠，10ml〕 4％濃縮〔兩超純水 4.85ml 3.16ml40％Acr/Bic〔37.5：1〕 2.5ml 0.5ml1.5mol/LTris?HCl〔pH8.8〕 2.5ml －0.5mol/LTris?HCl〔pH6.8〕 － 1.26ml10％SDS 100l 50l10%AP〔過硫酸胺〕 50l 25lTEMED 5l 5lTEMED后，馬上混勻即可灌膠。10SDS，0.5％溴酚藍(lán)，50％甘油〕0.5mol/LTris?HCl〔pH6.8〕 2.5ml二硫叔糖醇〔DTT，MW154.5〕 0.39gSDS 0.5g溴酚藍(lán) 0.025甘油 2.5ml1.5ml離心管中，4℃保存。電泳液緩沖液〔25mmol/LTris，0.25mol/L甘氨酸，0.1％SDS〕Tris〔MW121.14〕 3.03g甘氨酸〔MW75.07〕 18.77gSDS 1g蒸餾水至 1000ml3～5次。轉(zhuǎn)移緩沖液〔48mmol/LTris，39mmol/L甘氨酸，0.037％SDS，20％甲醇〕甘氨酸〔MW75.07〕 2.9gTris〔MW121.14〕 5.8gSDS 0.37g甲醇 200ml蒸餾水至 1000ml3～5次。10X麗春紅染液麗春紅S 2g三氯乙酸 30g磺基水楊酸 30g蒸餾水至 100ml10倍。TBS緩沖液〔100mmol/LTris?HClpH7.5,150mmol/LNaCl〕1mol/LTris?HCl〔pH7.5〕10mlNaCl 8.8g蒸餾水至 1000mlTBST緩沖液〔0.05％Tween20TBS緩沖液〕20％Tween20 1.65mlTBS 700ml混勻后即可使用，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。封閉液〔含5％脫脂奶粉的TBST緩沖液〕脫脂奶粉〔國產(chǎn)，安怡牌〕 5gTBST 100ml4℃保存。使用時(shí)，恢復(fù)室溫，用量以蓋過膜面即可，一次性使用。洗脫抗體緩沖液〔100mmol/L2-Mercaptoethanol，2％SDS，62.5mmol/LTris?HClpH6.8〕14.4mol/L2-Mercaptoethanol(β-巰基乙醇) 700 l〔通風(fēng)廚里加〕SDS 2g0.5mol/LTris?HCl〔pH6.8〕 12.5ml超純水至 100ml配制時(shí)，在通風(fēng)廚內(nèi)進(jìn)展。41次。顯影液〔5X〕自來水〔加熱至50℃〕 375ml 品加到溫水中〕米吐爾 1.55g亞硫酸鈉〔無水〕 22.5g碳酸鈉〔無水〕 33.75g溴化鉀 20.95g補(bǔ)水至 500ml配制時(shí)，上述藥品應(yīng)逐一參加，待一種試劑溶解后，再參加后一種試劑。4℃保1倍。定影液自來水〔50～60℃〕 700ml〔以下藥品按挨次參加前者溶解后再加后者〕硫代硫酸鈉 240g亞硫酸鈉〔無水〕 15g冰乙酸 12.6ml硼酸 7.5g鉀明礬 15g〔水溫冷至30℃以下時(shí)再參加〕加水定容至1000ml，室溫保存抗體用TBST0.5ml化學(xué)發(fā)光試劑SantaCruzAB兩種試劑。操作步驟：〔一〕蛋白樣品制備單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。?、倒掉培育液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培育液〔或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫菏故Ｓ嗯嘤毫鞯狡康兹缓笤儆靡埔浩鲗⑵湮摺场?3ml4PBS〔0.01MpH7.2～7.3〕。平放輕輕搖動1min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培育液。PBS棄凈后把培育瓶置于冰上。31ml10?lPMSF〔100mM〕，搖勻置于冰上?！睵MSF要搖勻至無結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合?！?400?lPMSF30min，為使細(xì)胞充分裂解培育瓶要常常來回?fù)u動。5、裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培育瓶的一側(cè)〔動作要快〕，然后用槍1.5ml離心管中?！舱麄€(gè)操作盡量在冰上進(jìn)展?！?412023rpm5min?！蔡崆伴_離心機(jī)預(yù)冷〕70.5min的離心管中放于－20℃保存。組織中總蛋白的提?。?1～2ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。2、加400?l單去污劑裂解液裂〔含PMSF〕于勻漿器中，進(jìn)展勻漿。然后置于冰上。3、幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。430min1.5ml4℃下12023rpm5min0.5ml離心管中并置于－20℃保存。加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。骸惨弧巢僮魍膺€應(yīng)收集培育液中的細(xì)胞。以下是培育液中細(xì)胞總蛋白的提?。?15ml2500rpm5min。2、棄上清，參加4mlPBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500rpm5min。棄PBS重復(fù)洗滌一次。3100?l裂解液〔PMSF〕30min，裂解過程中要常常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。44℃、12023rpm5min，取上清分0.5ml離心管中并置于－20℃保存?！捕车鞍缀康臏y定〔〔1〕制作標(biāo)準(zhǔn)曲線1、從－201mg/mlBSA，室溫溶化后，備用。2、取18個(gè)1.5ml離心管，3個(gè)一組，分別標(biāo)記為0mg，2.5mg，5.0mg，10.0mg，20.0mg，40.0mg。3、按下表在各管中參加各種試劑。0mg2.5mg5.0mg10.0mg20.0mg40.0mg1mg/mlBSA－2.5ml5.0ml10.0ml20.0ml40.0ml0.15mol/LNaCl100ml97.5ml95.0ml90.0ml80.0ml60.0mlG250考馬斯亮藍(lán)溶液1ml1ml1ml1ml1ml1ml4、混勻后，室溫放置2min。在生物分光光度計(jì)〔Bio－Photometer，Eppentoff〕上比色分析?！?〕檢測樣品蛋白含量11.5ml41ml。室溫放30min后即可用于測蛋白。20.15mol/LNaCl100l2分鐘可做為blank測空白樣品。32次〔0.5ml〕，再用無菌水洗一次。495l0.15mol/LNaClNaCl5?l待測蛋白樣品，2min，倒入扣干的比色杯中按sample鍵測樣品。25?l樣品含的蛋白量。〔三〕SDS－電泳清洗玻璃板再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。灌膠與上樣1、玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上預(yù)備灌膠?！膊僮鲿r(shí)要使兩玻璃對齊，以免漏膠。〕2、按前面方法配10％分別膠，參加TEMED后馬上搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)，可10ml5ml膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可。然后膠〔灌膠時(shí)開頭可快一些，膠面快到所需高度封時(shí)要很慢，否則膠會被沖變型?！?3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。44％的濃縮膠,TEMED后馬上搖勻即可灌膠。將剩余空間縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。5、用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中?！残〔ＡО迕鎸?nèi)，大玻璃板面對外。假設(shè)只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面對外?！?50?g蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品0.5ml5×SDS1×。〔上樣總體積一15?l20?l樣品。〕上樣前要將樣品于沸水中5min使蛋白變性。7、加足夠的電泳液后開頭預(yù)備上樣?！搽娪疽褐辽僖^內(nèi)測的小玻璃板?！场布訕犹炜墒箻悠窙_出加樣孔，假設(shè)有氣泡也可能使樣品溢3電泳4～5h40V60V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)展轉(zhuǎn)膜?！菜摹侈D(zhuǎn)膜67.0～8.3cm17.3～8.6cm的硝酸纖維2h才可使用?！灿描囎幽笞∧さ囊贿呡p輕置于有超純水的膜浸濕。假設(shè)膜沉入水里，膜與水之間形成一層空氣膜，這樣會阻擋膜吸水。紙和浸過的膜。將夾子翻開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾〔一手搟另一手要壓住墊子使其不能任憑移動?！吃趬|子搟去其中的氣泡。要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時(shí)候動作要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反〔撬時(shí)肯定要留神，玻板很易裂?！吵バ〔ＡО搴?，將濃縮膠輕輕刮去〔濃縮膠影響操作〕，要避開把分別搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個(gè)膠〔膜蓋下后不行再移動〕并除氣泡。在3〔〕60V轉(zhuǎn)移2h或40V3h。1×5min〔于脫色搖床上搖〕。然后用水沖洗〔五〕免疫反響TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖1h。TBST稀釋至適當(dāng)濃度〔1.5ml離心管中〕；撕下適當(dāng)大小的1～2h后，用TBST在10min；再用TBS洗一次，10min。同上方法預(yù)備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育1～2h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，進(jìn)展化學(xué)發(fā)光反響。〔六〕化學(xué)發(fā)光，顯影，定影AB兩種試劑在保鮮膜上等體積混合；1min后，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸；1min后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入X-光片夾中。在暗室中，將1×顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅燈下取出X－光片，用切紙刀剪裁適當(dāng)大小〔1cm〕；X-光片夾，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移動，關(guān)上X-光片夾，開頭計(jì)時(shí)；依據(jù)信1min5minX-X-光片，快速浸入顯影液中1～2mi〔2～25℃，溫度過低時(shí)〔16℃〕X-光片浸5～10min，以膠片透亮為止；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。否則會對結(jié)果產(chǎn)生影響?！财摺衬z圖象分析值。Westernblotanalysis-1Cellswereculturedin199mediumwith10%fetalbovineserum.Afterdigestionwith0.25%trypsinand0.2%EDTA,thecellswerecollectedandwerewashedthreetimeswithice-coldPBS,thenwerelysedinbuffer(50mMTris-HCl,pH8.0,150mMNaCl,100μg/ml PMSF,1%TritonX-100)for30minatice.Afterremovalofcelldebrisbycentrifugation(12,000g,5min),theproteinconcentrationoflysateswasmeaturedbyBradfordmethod.50μgproteinsofdifferentgroupsboiledfor5mininsamplebufferandwereseparatedin10%SDS-andtransferredontonitrocellulosemembrane(Bio-Rad).Nonspecificreactivitywasblockedbyincubationovernightat4℃inbuffer(10mMTris-HCl,pH7.5,150mMNaCl,2%Tween-20,4%bovinesreumalbumi