常用藥效篩選試驗(yàn)教程課件

常見藥效篩選試驗(yàn)常見藥效篩選試驗(yàn)

解表藥主要藥理作用：

1.發(fā)汗

2.解熱

3.鎮(zhèn)痛

4.抗病原微生物

5.抗炎

6.影響免疫功能常用藥：麻黃、桂枝、柴胡、葛根、荊芥、菊花、防風(fēng)等。清熱藥主要藥理作用：

1.

抗病原微生物2.解熱3.抗炎4.影響免疫功能5.抗自由基6.抗腫瘤

常用藥：黃芩、黃連、知母、赤芍、銀花、連翹、板藍(lán)根、穿心蓮、決明子、地骨皮等。解表藥主要藥理作用：清熱藥主要藥理作用：考察解表藥發(fā)汗作用汗法是中醫(yī)治療表證的重要方法之一，可以利用：汗液著色法、汗腺上皮組織形態(tài)觀察法和汗液定量測定法并結(jié)合皮膚電生理技術(shù)研究解表藥對(duì)汗腺分泌、汗腺活動(dòng)及汗液分泌量的影響。發(fā)汗機(jī)制：

擴(kuò)張汗腺導(dǎo)管，增加汗液分泌；興奮汗腺α受體、M受體，促進(jìn)汗液分泌；中樞神經(jīng)的調(diào)節(jié)及改善血液循環(huán)促進(jìn)發(fā)汗?？疾旖獗硭幇l(fā)汗作用汗法是中醫(yī)治療表證的重要方法之一，可以利用考察解熱作用方法：常采用菌苗或內(nèi)毒素等引起的感染性發(fā)熱以及用松節(jié)油和二硝基苯酚等引起的非感染性發(fā)熱觀察受試藥物的退熱作用。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)性發(fā)熱大鼠體溫調(diào)節(jié)中樞溫度敏感神經(jīng)元放電頻率及發(fā)熱動(dòng)物腦脊液中PGE、cAMP含量的影響，分析解表藥作用機(jī)制和部位?？疾旖鉄嶙饔梅椒ǎ撼２捎镁缁騼?nèi)毒素等引起的感染性發(fā)熱以及用觀察清熱藥的解熱作用

發(fā)熱是里熱證的重要表現(xiàn)，研究清熱藥應(yīng)首選以內(nèi)毒素所致的發(fā)熱反應(yīng)，其次如酵母性發(fā)熱、角叉菜膠所致發(fā)熱及二硝基酚性發(fā)熱也可選用，還可選用內(nèi)生致熱原生成及致熱試驗(yàn)、微量PGE腦室內(nèi)或下丘腦注射致熱試驗(yàn)等用于研究清熱藥的解熱作用。觀察清熱藥的解熱作用發(fā)熱是里熱證的重要表現(xiàn)，研究清熱解熱實(shí)驗(yàn)（解表藥、清熱藥）家兔：IV傷寒、副傷寒聯(lián)合菌苗、內(nèi)毒素致熱大鼠：鮮酵母液皮下注射致熱方法：隨機(jī)分組后，先測量各動(dòng)物給藥前正常體溫，給藥后30分鐘造模，于致熱物質(zhì)注射后的5、30、60、90、120、240min時(shí)間點(diǎn)測量動(dòng)物的體溫，計(jì)算體溫升高的百分率。解熱實(shí)驗(yàn)（解表藥、清熱藥）家兔：IV傷寒、副傷寒聯(lián)合菌苗、內(nèi)（三）觀察抗炎、抗過敏作用炎癥是表證證候的主要病理過程。抗炎是解表治療的主要對(duì)癥措施。解表藥物對(duì)炎癥的早、中、晚期均有作用，但考慮表證的特點(diǎn)，解表藥的抗炎作用評(píng)價(jià)應(yīng)以滲出、腫脹、白細(xì)胞游走或毛細(xì)血管通透性增強(qiáng)等急性炎癥過程為主要觀察指標(biāo)，觀察受試藥物的抗炎作用。（三）觀察抗炎、抗過敏作用炎癥是表證證候的主要病理過程。抗炎觀察清熱藥的抗炎作用

清熱藥主要用于急性傳染、感染性炎性疾病，其抗炎作用的主要特點(diǎn)是以抑制早期炎癥為強(qiáng)，對(duì)中、晚期炎癥作用相對(duì)較弱或無，這與其在臨床能較快解除以紅、熱、腫、痛為特點(diǎn)的“熱證”相吻合，以感染初期的炎性滲出、毛細(xì)血管通透性亢進(jìn)為主要觀察指標(biāo)，研究清熱藥的抗炎作用。觀察清熱藥的抗炎作用清熱藥主要用于急性傳染、感染性炎性抗過敏試驗(yàn)變態(tài)反應(yīng)臨床分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。其中Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)的發(fā)病機(jī)制較為清楚，多數(shù)試驗(yàn)方法反映Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)的發(fā)病機(jī)制，包括被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)試驗(yàn)（passivecutaneousanaphylaxis，PCA）、過敏性支氣管痙攣試驗(yàn)、Schultz-Dale反應(yīng)試驗(yàn)、抗過敏介質(zhì)試驗(yàn)及肥大細(xì)胞試驗(yàn)等。抗過敏試驗(yàn)變態(tài)反應(yīng)臨床分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。其中Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)

小鼠耳廓腫脹法：致炎物質(zhì)有巴豆油、二甲苯

大鼠足跖腫脹法：致炎物有蛋清、角叉菜膠、甲醛等。

血管通透性實(shí)驗(yàn)：靜脈注射伊文氏蘭，觀察染料在皮下組織的滲出量。

肉芽組織增生實(shí)驗(yàn)：手術(shù)皮下置入固定量棉球，一段時(shí)間后，取出棉球稱重。比較給藥與不給藥組動(dòng)物身上取出棉球重量的差異。常用抗炎實(shí)驗(yàn)方法小鼠耳廓腫脹法：致炎物質(zhì)有巴豆油、二甲苯常用抗炎實(shí)驗(yàn)方足趾容積測量儀足趾容積測量儀抗炎實(shí)驗(yàn)—祛風(fēng)濕藥佐劑型關(guān)節(jié)炎：免疫性關(guān)節(jié)炎病理模型。

佐劑的制備：取凍干卡介苗50mg，80°C，1小時(shí)滅活，混入滅菌石蠟油、羊毛脂（1：1）12.5ml，制成完全佐劑。

造模方法：無菌條件下足趾皮下注射0.1ml，19天后開始給藥。

觀察指標(biāo)：體重、足趾厚度、致炎后12天開始觀察繼發(fā)性全身關(guān)節(jié)病變程度，計(jì)算關(guān)節(jié)炎指數(shù)。電鏡觀察關(guān)節(jié)滑膜組織細(xì)胞有無腫脹、變性、壞死?？寡讓?shí)驗(yàn)—祛風(fēng)濕藥佐劑型關(guān)節(jié)炎：免疫性關(guān)節(jié)炎病理模型?？寡讓?shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)-致炎因子高遷移率族蛋白B1（HMGB1）：是一種DNA結(jié)合蛋白，作為細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)。該后期致炎因子可導(dǎo)致敗血癥，是抗炎治療的一種新的靶分子。腫瘤壞死因子（TNF）：是重要的早期一過性釋放的致炎因子。白介素1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）、白介素10（IL-10）、白介素8（IL-8）前列腺素（PGE2）、白三烯MIP-1α、MIP-1β：巨噬細(xì)胞炎癥蛋白抗炎實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)-致炎因子高遷移率族蛋白B1（HMGB1）：HMGB1

炎癥發(fā)生12～18小時(shí)后血清HMGB1活性最高并維持水平，而TNF、IL-1等因子只是在炎癥發(fā)生后幾小時(shí)內(nèi)達(dá)到峰值后又回到基礎(chǔ)水平。因此，特異地抑制HMGB1的釋放和活性是一種非常有希望的抗炎策略，尤其是治療炎癥晚期所引起的敗血癥。研究還發(fā)現(xiàn)，由受損組織和活化的免疫細(xì)胞釋放的HMGB1可作為自身免疫原引起自身免疫性疾病，如RA（類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎）、SLE（系統(tǒng)性紅斑狼瘡）等。HMGB1也是治療自身免疫性疾病重要的靶分子。HMGB1炎癥發(fā)生12～18小時(shí)后血清HMGB

炎性疾病

(AS、多臟器纖維化)

毒損肺絡(luò)

(與呼吸道疾病相關(guān))

血栓性疾病

(組織缺血所致炎癥級(jí)連反應(yīng))毒損腦絡(luò)(腦病相關(guān))

“清熱解毒”功效——抑制炎癥反應(yīng)

注意：不同疾病檢測部位和指標(biāo)有所區(qū)別非選擇性抗炎作用（角叉菜膠足腫脹、二甲苯耳腫脹）不是主要。注意：退熱抗炎抗肺纖維化抗多臟衰竭作用抑制病原體改善癥狀治療呼吸道病毒感染的研究內(nèi)容退熱抑制病原體改善癥狀治療呼吸道病毒感染的研究內(nèi)容急性呼吸窘迫綜合癥多器官功能障礙綜合征

急性呼吸窘迫綜合癥多器官功能障礙綜合征觀察指標(biāo)流感病毒肺炎模型肺指數(shù)、死亡率流感病毒所致小鼠肺炎的保護(hù)抑制呼吸道炎癥血清、肺組織與炎癥有關(guān)細(xì)胞因子急性期：

NO、EOS、IL-1、IL-4、IFN-Y、TNF-A等感染中后期：

TNF-A（感染后12小時(shí)達(dá)峰）堿性遷移蛋白（感染后72小時(shí)達(dá)峰）觀察指標(biāo)流感病毒肺炎模型流感病毒所致小鼠肺炎的保護(hù)抑制呼吸道（—）（—）（—）（—）5HPETE腦水腫PGG2腦缺血/再灌注Ca2+相關(guān)第二信使傳導(dǎo)系統(tǒng)激活內(nèi)皮小膠質(zhì)神經(jīng)元釋放IL-1βTNF-α、IL-10等炎性因子激活第二信使系統(tǒng)蛋白激酶磷酸酶NF-κB、STAT等轉(zhuǎn)錄因子激活黏附分子、趨化因子表達(dá)增加白細(xì)胞浸潤分泌MMPBBB破壞神經(jīng)元損傷壞死或凋亡磷脂外周NSE增高AA釋放增加PGH2PGD2PGE2TXA2等5-LOXCOX腦缺血再灌注損傷的炎癥代謝網(wǎng)絡(luò)磷脂酶A2LTA4LTB4CYsTsLTA4H神經(jīng)元特異性烯醇化酶

（—）（—）（—）（—）5HPETE腦水腫PGG2腦缺血/再（四）觀察鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用

肌肉酸痛、煩躁是表證主要癥狀之一，鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜試驗(yàn)是考核解表藥對(duì)癥治療作用的常用方法。致痛方法有物理性（熱、電、機(jī)械）和化學(xué)性（醋酸、鉀離子、緩激肽、催產(chǎn)素等）兩類，常用動(dòng)物為小鼠、大鼠、豚鼠、家兔或犬等。常用評(píng)價(jià)指標(biāo)為嘶叫、舔足、甩尾、掙扎或皮膚及肌肉抽動(dòng)等。鎮(zhèn)靜試驗(yàn)：觀察受試藥物對(duì)動(dòng)物一般行為（非條件行為）的影響，判斷是否有中樞抑制（或興奮）作用，記錄方法有直接觀察（行為分級(jí)）和儀器記錄兩類。（四）觀察鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用肌肉酸痛、煩躁是表證主要癥狀之一，鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)方法：機(jī)械刺激、電刺激、熱刺激、化學(xué)刺激致痛法（造模物質(zhì)）檢測指標(biāo)：痛閾值、痛閾提高百分率。冰醋酸、酒石酸銻鉀常用動(dòng)物：小白鼠、大白鼠鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)方法：機(jī)械刺激、電刺激、熱刺激、化學(xué)刺激致痛法（造模智能熱板儀電子壓痛儀實(shí)驗(yàn)儀器智能熱板儀電子壓痛儀實(shí)驗(yàn)儀器考察鎮(zhèn)靜、催眠作用自發(fā)活動(dòng)觀察：吊籠法、曠野法、活動(dòng)儀睡眠實(shí)驗(yàn)：觀察指標(biāo)有潛伏期、睡眠時(shí)間（翻正反射消失時(shí)間）、睡眠發(fā)生率考察鎮(zhèn)靜、催眠作用自發(fā)活動(dòng)觀察：吊籠法、曠野法、活動(dòng)儀睡眠實(shí)觀察抗菌、抗病毒作用

里熱證的病因多為病原微生物感染，因而需進(jìn)行清熱藥的抗菌、抗病毒研究，中藥對(duì)急性感染具有“廣譜”的特點(diǎn)，宜選用較廣泛的菌株進(jìn)行體外抗菌試驗(yàn)，選用敏感菌株進(jìn)行感染動(dòng)物的保護(hù)試驗(yàn)。并注意對(duì)細(xì)菌感染過程各階段的影響，如對(duì)細(xì)菌于粘膜表面的粘附能力的影響；對(duì)細(xì)菌耐藥性的影響等?？共《倔w外實(shí)驗(yàn)：通常采用病毒雞胚接種法或組織細(xì)胞培養(yǎng)法，測定病毒生長情況及觀察細(xì)胞病變情況，評(píng)價(jià)藥物對(duì)病毒增殖的抑制作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)是將病毒接種于易感動(dòng)物體內(nèi)造成病毒感染，給予中藥（在感染前或/和感染后給藥）進(jìn)行干預(yù)，以動(dòng)物存活率、存活時(shí)間或以動(dòng)物器官病變程度等指標(biāo)來判斷藥物抗病毒作用。由于清熱藥的多成分干擾，抗菌、抗病毒作用應(yīng)以體內(nèi)研究為主。觀察抗菌、抗病毒作用里熱證的病因多為病原微生物感染，因而抗菌實(shí)驗(yàn)（清熱藥）體外：管碟法、平皿法（抑菌圈直徑、最低抑菌濃度和最低殺菌濃度）體內(nèi)：整體動(dòng)物感染細(xì)菌（最低致死濃度感染），觀察死亡率。抗細(xì)菌毒素抗菌實(shí)驗(yàn)（清熱藥）體外：管碟法、平皿法（抑菌圈直徑、最低抑菌觀察清熱藥的抗內(nèi)毒素作用內(nèi)毒素（endotoxin）是革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁成分，在細(xì)菌死亡自溶或粘附在其他細(xì)胞時(shí)，才表現(xiàn)其毒性。內(nèi)毒素的主要化學(xué)成分是脂多糖中的類脂A成分。清熱藥抗內(nèi)毒素作用研究主要有四個(gè)方面：增強(qiáng)機(jī)體對(duì)內(nèi)毒素的解毒能力；改善機(jī)體對(duì)內(nèi)毒素的反應(yīng)性；消除腸源性內(nèi)毒素池及直接使內(nèi)毒素解毒。實(shí)驗(yàn)方法：采用給動(dòng)物靜脈注射大腸桿菌或傷寒桿菌的內(nèi)毒素形成內(nèi)毒素血癥，或夾閉大鼠的腸上動(dòng)脈造成腸源性的內(nèi)毒素池觀察藥物對(duì)模型動(dòng)物的體溫變化、白細(xì)胞數(shù)量、血液流變學(xué)、微循環(huán)及死亡率等指標(biāo)的影響。觀察清熱藥的抗內(nèi)毒素作用內(nèi)毒素（endotoxin）是革蘭氏觀察清熱藥對(duì)血液系統(tǒng)及微循環(huán)的影響

發(fā)熱失水可致血液濃縮，病原體及其毒素可以激活血小板、內(nèi)外凝血系統(tǒng)繼而出現(xiàn)血凝活性異常，呈現(xiàn)“熱瘀互結(jié)”、“氣血兩燔”、“耗血?jiǎng)友薄Ｎ⒀h(huán)障礙不僅造成局部的“缺血缺氧”環(huán)境而損傷機(jī)體抗感染防御能力，也給藥物的多種療效帶來困難。針對(duì)清熱涼血藥可從抑制血小板聚集、抗血栓形成、改善血液流變性等方面開展研究。觀察清熱藥對(duì)血液系統(tǒng)及微循環(huán)的影響發(fā)熱失水可致血液濃理氣藥、芳香化濕藥、瀉下藥、消食藥

------主要作用于消化系統(tǒng)瀉下藥主要藥理作用：瀉下、利尿、抗病原微生物、抗炎、抗腫瘤。芳香化濕藥主要藥理作用：對(duì)消化道的調(diào)節(jié)作用、抗病原微生物作用。理氣藥的主要藥理作用：對(duì)消化道的雙向調(diào)節(jié)作用、利膽、松弛支氣管平滑肌、心血管系統(tǒng)影響、對(duì)子宮的作用等。理氣藥、芳香化濕藥、瀉下藥、消食藥

------主要作用于消觀察瀉下作用及致瀉機(jī)理的研究

常采用腸管動(dòng)力實(shí)驗(yàn)法觀察此類藥物的瀉下作用，研究瀉下作用部位、作用方式?？刹捎檬忝啬Ｐ?、地芬諾酯模型、次炭酸鉍大鼠便秘模型、實(shí)熱型便秘模型等重點(diǎn)觀察藥物的通便作用及腸道水分吸收的影響。不吸收觀察瀉下作用及致瀉機(jī)理的研究常采用腸管動(dòng)力實(shí)驗(yàn)法觀察此類腸內(nèi)容物推進(jìn)速度試驗(yàn)法碳末推進(jìn)實(shí)驗(yàn)（瀉下藥）碳末排出時(shí)間試驗(yàn)（瀉下或止瀉）酚紅定量測定法（測定胃腸道不同部位的酚紅含量，分析胃排空速度和不同腸段的推進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能。（對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)的影響）胃動(dòng)素、胃泌素的測定（理氣藥）腸內(nèi)容物推進(jìn)速度試驗(yàn)法對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)的影響檢測小鼠胃內(nèi)容物中甲基橙光密度來考察藥物對(duì)小鼠胃排空機(jī)能的影響；采用胃腸內(nèi)標(biāo)記物葡聚糖藍(lán)-2000在胃內(nèi)色素相對(duì)殘留率及小腸推進(jìn)比，觀察藥物對(duì)胃排空及腸推進(jìn)的影響；采用胃腸動(dòng)力障礙模型，觀察藥物對(duì)腸蠕動(dòng)減緩的拮抗效應(yīng)。體外觀察藥物對(duì)動(dòng)物離體胃、腸平滑肌活動(dòng)的影響，并可觀察藥物對(duì)乙酰膽堿、阿托品（M阻斷）、六烴季胺（N阻斷）、心得安（β阻斷）、酚妥拉明（α阻斷）等胃腸作用的影響，初步了解其作用機(jī)制。芬氟拉明致胃動(dòng)力障礙模型，鹽酸多巴胺致胃排空延遲模型，L-Arg（左旋精氨酸）致胃動(dòng)力障礙模型對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)的影響檢測小鼠胃內(nèi)容物中甲基橙光密度來考察藥物對(duì)小

胃排空實(shí)驗(yàn)取24小時(shí)禁食不禁水小鼠50只，隨機(jī)分組后給藥，40min后將各鼠灌0.1%甲基橙0.2ml，再過20min后將小鼠脫頸椎處死。取胃置于裝有5ml蒸餾水的小燒杯中，剪開胃大彎，沖冼胃內(nèi)容物，用NaHCO3調(diào)PH值至6～6.5，倒入刻度離心管，以2000r·min-1離心10min，取上清液用UV-9100紫外可見分光光度計(jì)于420nm處比色，另準(zhǔn)備10ml蒸餾水加入0.1%的甲基橙0.2ml為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。測量各組吸光度,并計(jì)算殘留百分率。

胃中甲基橙殘留率(%)=胃中沖洗上清液吸光度/甲基橙對(duì)照管吸光度*100%。胃排空實(shí)驗(yàn)?zāi)c推進(jìn)率實(shí)驗(yàn)取24小時(shí)禁食不禁水小白鼠，隨機(jī)分組，每組10只，灌胃給藥，30分鐘后斷頸椎處死動(dòng)物，打開腹腔，取出全部腸組織。測量。

腸推進(jìn)率%=幽門到碳末前沿的距離/小腸全長*100%腸推進(jìn)率實(shí)驗(yàn)胃動(dòng)素（MTL）、胃泌素（GAS）測定（理氣藥）

大鼠，隨機(jī)分組后，灌胃給藥每天1次，連續(xù)四周。每天記錄進(jìn)食量，每周稱體重調(diào)節(jié)給藥量。于末次給藥后24小時(shí)麻醉大鼠，頸動(dòng)脈取血，2ml血抗凝處理測血漿MTL；3ml血不做抗凝處理，用于測定血清GAS。

胃泌素幾乎對(duì)整個(gè)胃腸道均有作用，它可促進(jìn)胃腸道的分泌功能；促進(jìn)胃竇，胃體收縮，增加胃腸道的運(yùn)動(dòng)，同時(shí)促進(jìn)幽門括約肌收縮，故其整體綜合作用是延緩胃排空而不是促進(jìn)胃排空；促進(jìn)胃及上部腸道粘膜細(xì)胞的分裂增殖；促進(jìn)胰島素和降鈣素的釋放。

胃動(dòng)素是一種多肽，在空腸粘膜的濃度最高，有強(qiáng)烈刺激上消化道的機(jī)械運(yùn)動(dòng)和生理性肌電活動(dòng)的作用。胃動(dòng)素（MTL）、胃泌素（GAS）測定（理氣藥）胃泌素幾乎對(duì)抗腹瀉作用（理氣藥）甲硫酸新斯的明造成小鼠小腸痙攣模型，觀察藥物對(duì)小腸痙攣的拮抗作用。番瀉葉與蓖麻油引起腹瀉的小鼠模型，觀察藥物對(duì)腹瀉潛伏期、腹瀉率、腹瀉級(jí)數(shù)及腹瀉指數(shù)的影響。抗腹瀉作用（理氣藥）甲硫酸新斯的明造成小鼠小腸痙攣模型，觀察

濕糞計(jì)數(shù)法藥物對(duì)正常小鼠排便的影響；對(duì)新斯的明和蓖麻油致腹瀉的對(duì)抗作用(止瀉）。（觀察服藥后一定時(shí)間內(nèi)排出的濕糞粒數(shù)）。在體腸實(shí)驗(yàn)

1、腸管懸掉法

2、腸內(nèi)應(yīng)變片法（放應(yīng)變片）或內(nèi)壓法（球囊）。應(yīng)變片法：將半導(dǎo)體應(yīng)變片縫置在胃腸漿膜上，通過壓力傳感箱，將收縮活動(dòng)記錄下來。一個(gè)電阻元件，將應(yīng)變片用粘合劑粘貼在被測試件的表面上，隨著試件受力變形，應(yīng)變片的敏感柵也獲得同樣的變形，其電阻隨之發(fā)生變化，電阻變化轉(zhuǎn)換為電壓或電流變化，記錄下來，可反映被測試件應(yīng)變量的大小。濕糞計(jì)數(shù)法在體腸實(shí)驗(yàn)一個(gè)電阻元件，將應(yīng)變片用粘合劑粘貼在離體腸實(shí)驗(yàn)定性：看曲線定量：拉丁方設(shè)計(jì)給藥（排除離體時(shí)間不同和藥物影響帶來的差異），足夠樣本數(shù)；根據(jù)實(shí)驗(yàn)曲線定量測量振幅和頻率的變化，以率表現(xiàn)較合理。（差值是個(gè)絕對(duì)數(shù)，率是相對(duì)數(shù)）離體腸實(shí)驗(yàn)助消化、助吸收的作用（理氣藥、消食藥）對(duì)胃分泌功能的影響：胃酸含量及胃蛋白酶活性小腸葡萄糖吸收功能：右旋木糖吸收試驗(yàn)，3H-葡萄糖吸收試驗(yàn)胰液分泌功能：檢測胰液分泌量及胰蛋白含量對(duì)脾虛模型動(dòng)物影響：一般癥狀和體征的影響，并重點(diǎn)從胃液分泌、胃腸運(yùn)動(dòng)、胃腸激素及胃腸黏膜的病理形態(tài)改變等評(píng)價(jià)其作用及機(jī)制。助消化、助吸收的作用（理氣藥、消食藥）對(duì)胃分泌功能的影響：胃觀察瀉下藥抗感染、抗腸粘連作用

瀉下藥不僅可增強(qiáng)腸蠕動(dòng)，還可從抗病原微生物、抗炎解熱、改善血液循環(huán)，促進(jìn)腸腔滲出液吸收，改善腸粘連和腸缺血入手考察本類藥物對(duì)急腹癥的治療作用。建立套疊性腸梗阻模型觀察藥物促進(jìn)腸套疊還納，解除腸梗阻的作用；利用缺血性腸梗阻模型考察藥物對(duì)缺血性梗阻腸管血循環(huán)作用；通過觀察藥物對(duì)細(xì)菌性腸粘連模型的影響，研究藥物對(duì)腸粘連及炎性滲出等作用。觀察瀉下藥抗感染、抗腸粘連作用瀉下藥不僅可增強(qiáng)腸蠕動(dòng)，芳香化濕藥還可以進(jìn)行相關(guān)抗炎、鎮(zhèn)痛作用研究。探討其作用機(jī)制，可以測定血清和組織中胃動(dòng)素和胃泌素，以及P物質(zhì)、血管活性腸肽的含量變化，考察對(duì)內(nèi)分泌激素和腦腸肽的影響；測定胃腸道組織超氧化歧化酶活性、丙二醛含量，考察抗氧化活性。

濕邪影響到多器官功能的發(fā)揮，很多現(xiàn)代疾病與芳香化濕藥所主治的病證有不同程度相關(guān)性。包括胃腸型感冒、功能性消化不良、消化性潰瘍、肝炎等消化系統(tǒng)疾病，慢性感染性疾病，老年性癡呆、癲癇等神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病，動(dòng)脈粥樣硬化、心肌缺血、心律失常等心血管系統(tǒng)疾病，腫瘤，以及各種原因引起的組織器官氧化損傷、炎癥反應(yīng)等。芳香化濕藥還可以進(jìn)行相關(guān)抗炎、鎮(zhèn)痛作用研究。濕邪考察抗?jié)冏饔脤?duì)不同因素致潰瘍模型動(dòng)物的影響造模：水浸應(yīng)激性胃潰瘍、乙酸燒灼性胃潰瘍、幽門結(jié)扎型胃潰瘍、乙醇損傷胃黏膜模型、利血平潰瘍模型。觀察指標(biāo)：測量胃液量、胃液酸度、游離鹽酸和總酸度測定，胃蛋白酶活性測定。黏膜中及血中PGE2含量等，組織學(xué)觀察潰瘍面積、潰瘍點(diǎn)數(shù)，計(jì)算潰瘍指數(shù)（面積）、潰瘍抑制率?？疾炜?jié)冏饔脤?duì)不同因素致潰瘍模型動(dòng)物的影響考察藥物利膽作用—理氣藥、瀉下藥觀察膽汁分泌量并通過分析膽汁中膽固醇、膽紅素、膽汁酸以及無機(jī)離子等含量，研究藥物對(duì)膽汁分泌、排泄和代謝的影響；通過膽囊運(yùn)動(dòng)及膽道括約肌緊張度實(shí)驗(yàn)，研究藥物對(duì)膽囊壓力、膽囊排空的影響；建立膽道感染、膽結(jié)石及胰腺炎病理實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停^察藥物的治療作用。考察藥物利膽作用—理氣藥、瀉下藥觀察膽汁分泌量并通過分析膽汁抗肝損傷實(shí)驗(yàn)

肝細(xì)胞損傷的體外模型：分離培養(yǎng)肝細(xì)胞，造損傷模型（四氯化碳、醋氨酚、過氧化氫、氰化鉀、硫代乙酰胺、內(nèi)毒素、半乳糖胺）肝細(xì)胞分泌功能測定：膠原生成率、白蛋白分泌量、ALT\AST測定、CAMP\CGMP測定、肝細(xì)胞DNA合成速率測定、肝細(xì)胞谷胱甘肽過氧化物酶活性測定。肝星狀細(xì)胞體外模型及功能測定：對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖的測定、膠原生成率測定。星狀細(xì)胞合成和分泌膠原及糖蛋白、蛋白多糖等基質(zhì)成分，

HSC是正常及纖維化肝臟中細(xì)胞外基質(zhì)的主要合成細(xì)胞，可以分泌肝細(xì)胞生長因子（HGF），參與肝細(xì)胞再生的調(diào)控；儲(chǔ)存脂肪

。

抗肝損傷實(shí)驗(yàn)肝細(xì)胞損傷的體外模型：分離培養(yǎng)肝細(xì)胞，造損

實(shí)驗(yàn)性肝損傷體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：化學(xué)性肝損傷（四氯化碳、氨基半乳糖、撲熱息痛）、免疫性肝損傷（卡介苗和脂多糖誘導(dǎo)肝損傷、刀豆蛋白A誘導(dǎo)肝損傷）、酒精性肝損傷（可采用復(fù)合因素，酒精灌胃法、酒精飲料模型、酒精液體食料模型、酒精加內(nèi)毒素模型、酒精加鐵過載模型）實(shí)驗(yàn)性肝損傷體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：化學(xué)性肝損傷（四氯化碳、氨基半乳糖改善神經(jīng)精神活動(dòng)作用—理氣藥功能性消化不良是抑郁證的共病之一，通過調(diào)節(jié)胃腸功能可改善抑郁癥患者的神經(jīng)精神癥狀。抑郁癥的動(dòng)物模型主要可分為兩類：一類屬于藥物誘發(fā)的模型，包括育亨賓模型，5-HTP誘發(fā)甩頭行為，利血平致單胺類遞質(zhì)耗竭模型等；另一類為改變環(huán)境條件誘發(fā)的抑郁模型，如束縛、隔離、疲勞應(yīng)激、行為絕望、慢性不可預(yù)知應(yīng)激、慢性溫和應(yīng)激等。此外，還有腦損傷致抑郁癥模型（如嗅球切除模型）以及90年代以來出現(xiàn)的基因選擇的大鼠行為抑郁模型如游泳低活性模型、FSL（Flinderssensitiveline，遺傳行為抑郁大鼠）大鼠模型等。改善神經(jīng)精神活動(dòng)作用—理氣藥功能性消化不良是抑郁證的共病之一溫里藥藥理作用對(duì)消化系統(tǒng)作用：增加胃腸動(dòng)力，促進(jìn)消化、抗?jié)儗?duì)心血管系統(tǒng)作用：強(qiáng)心、抗心肌缺血、抗休克對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)作用：促進(jìn)激素的合成、分泌，抗炎、增加產(chǎn)熱、抗寒冷。溫里藥藥理作用對(duì)消化系統(tǒng)作用：增加胃腸動(dòng)力，促進(jìn)消化、抗?jié)兛剐菘藢?shí)驗(yàn)休克模型：

失血性休克模型

內(nèi)毒素誘導(dǎo)感染性休克模型燒傷引起休克模型

家兔腸系膜上動(dòng)脈閉塞性休克模型抗休克實(shí)驗(yàn)休克模型：心源性休克可用物理或化學(xué)方法損傷心肌，冠狀動(dòng)脈阻塞法（結(jié)扎、栓塞等），誘發(fā)心源性休克，觀察其藥理作用?？刹捎醚獕簻y定儀或生理記錄儀測定動(dòng)物正常血壓及低血壓狀態(tài)的血壓，觀察藥物對(duì)低血壓狀態(tài)的影響以判斷該藥是否具有抗休克作用。可對(duì)休克模型血流動(dòng)力學(xué)、微循環(huán)、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)以及代謝、體液因子和毒素等方面的改變進(jìn)行研究。心源性休克可用物理或化學(xué)方法損傷心肌，冠狀動(dòng)脈阻塞法（結(jié)扎、考察強(qiáng)心作用采用心衰模型觀察藥物對(duì)心肌收縮率、心率和心輸出量的影響；結(jié)合不同模型進(jìn)行心肌病理、超微結(jié)構(gòu)觀察，檢測血中神經(jīng)內(nèi)分泌相關(guān)指標(biāo)研究藥物治療心衰的作用機(jī)制體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)法可以對(duì)心肌興奮性、不應(yīng)性、自動(dòng)節(jié)律等指標(biāo)定量觀察，還可以觀察中藥對(duì)心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率和收縮力的影響，進(jìn)而分析作用原理。離體心臟實(shí)驗(yàn)考察強(qiáng)心作用采用心衰模型觀察藥物對(duì)心肌收縮率、心率和心輸出量抗心肌缺血缺氧作用采用心肌缺血模型、心肌缺血再灌注損傷模型、心肌缺血缺氧模型，通過心臟功能，血流動(dòng)力學(xué)，血液流變學(xué)試驗(yàn)，心肌耗氧量試驗(yàn)，擴(kuò)張外周血管及微循環(huán)試驗(yàn)，定量分析藥物對(duì)心肌損傷程度、心臟功能的影響?？疾鞂?duì)血小板活性和微循環(huán)的影響、抗氧自由基作用、調(diào)節(jié)細(xì)胞釋放NO的影響、心肌酶的影響、心肌細(xì)胞凋亡的影響，探討藥物抗心肌缺血的作用機(jī)制?？剐募∪毖毖踝饔貌捎眯募∪毖Ｐ?、心肌缺血再灌注損傷模型、血液系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)（止血藥、活血化瘀藥）止血：出血時(shí)間、血漿復(fù)鈣時(shí)間、凝血時(shí)間、凝血因子的影響。補(bǔ)血：RBC\WBC\PLT\HB,骨髓造血系統(tǒng)（骨髓造血干/祖細(xì)胞的增殖和分化，抑制凋亡）活血：血液流變學(xué)（濃、粘、凝、聚指標(biāo)）、動(dòng)力學(xué)（血管照影）、微循環(huán)指標(biāo)改善（微血管、微血流、毛細(xì)血管通透性）血液黏度、血液的觸變性，黏彈性、紅細(xì)胞壓積等；紅細(xì)胞類指標(biāo)如紅細(xì)胞聚集性，紅細(xì)胞變形性、紅細(xì)胞膜的微黏度、紅細(xì)胞電泳等，血小板類指標(biāo)：如血小板聚集性、血小板黏附性、血栓彈力度、體外血栓的形成與測定等；血漿類指標(biāo)：如血漿黏度、血漿纖維蛋白原等血液系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)（止血藥、活血化瘀藥）止血：出血時(shí)間、血漿復(fù)鈣時(shí)對(duì)凝血系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)功能的影響股動(dòng)脈切口試驗(yàn)及小鼠剪尾試驗(yàn)檢測藥物對(duì)出血時(shí)間及出血量的影響；監(jiān)測凝血時(shí)間、活化部分凝血活酶時(shí)間分析藥物對(duì)內(nèi)源性凝血途徑的影響；監(jiān)測凝血酶原時(shí)間（PT），分析藥物對(duì)外源性凝血系統(tǒng)的影響；監(jiān)測凝血酶時(shí)間（thrombintime，TT）研究藥物對(duì)凝血、抗凝及纖維蛋白溶解系統(tǒng)功能影響；監(jiān)測血漿纖維蛋白原、纖維蛋白肽A（FPA）、凝血酶原片段F1+2、組織因子、可溶性纖維蛋白單體復(fù)合物、因子IX-35、IX-9、因子X-52、X-15肽片段研究藥物對(duì)凝血系統(tǒng)的影響。對(duì)凝血系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)功能的影響股動(dòng)脈切口試驗(yàn)及小鼠剪尾試驗(yàn)檢對(duì)血小板功能的影響檢測血小板黏附功能：玻璃珠法、玻璃纖維法、灌注小室法；檢測血小板聚集功能：比濁法、比值法；檢測血小板釋放功能：β-血小板球蛋白（β-TG）、血小板活化因子4（PF4）、5-HT、血漿α顆粒膜糖蛋白-140（GMP-140）等血小板與紅細(xì)胞、白細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用也是血小板參與凝血過程的機(jī)制之一，因此，檢測他們之間的相互作用有重要意義。對(duì)血小板功能的影響檢測血小板黏附功能：玻璃珠法、玻璃纖維法、對(duì)血流動(dòng)力學(xué)影響-止血、活血體外實(shí)驗(yàn)：采用離體器官血管灌流法（兔耳、下肢、肝、腎、腸系膜血管）、離體主動(dòng)脈條實(shí)驗(yàn)法等研究藥物對(duì)血管的舒縮作用。對(duì)心肌缺血和腦缺血模型動(dòng)物的改善。體內(nèi)可通過在體局部血管阻力測定法和通過檢測血管活性物質(zhì)觀察藥物作用。檢測平均動(dòng)脈血壓、總外周阻力、每搏輸出量、組織器官血流量、心臟指數(shù)、動(dòng)脈順應(yīng)性。血管造影（圖像分析）考察整體動(dòng)物動(dòng)力學(xué)改變。對(duì)血流動(dòng)力學(xué)影響-止血、活血體外實(shí)驗(yàn)：采用離體器官血管灌流法抗血栓形成①針對(duì)血管內(nèi)皮損傷：血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，分別測定內(nèi)皮細(xì)胞釋放的活性物質(zhì)，如前列腺素、vWF因子、內(nèi)皮素和內(nèi)皮細(xì)胞松弛因子等；②針對(duì)血小板功能異常：血小板黏附性測定法、血小板聚集功能測定法及測定血小板釋放反應(yīng)活性物質(zhì)，如5-HT、TXA2、ADP和血小板第四因子(PF4)等，綜合評(píng)價(jià)血小板功能；③針對(duì)凝血活性增高：運(yùn)用凝血時(shí)間測定方法、凝血因子活力或含量測定方法，如血漿復(fù)鈣時(shí)間、凝血酶原時(shí)間、部分凝血活酶時(shí)間的測定和纖維蛋白溶解試驗(yàn)等。體外血栓形成法：按照Chandler法，在體外旋轉(zhuǎn)環(huán)內(nèi)模擬體內(nèi)血液流動(dòng)狀態(tài)，形成血栓；體內(nèi)血栓形成法：動(dòng)脈血栓形成法，有實(shí)驗(yàn)性動(dòng)-靜脈旁路血栓形成法、電刺激頸總動(dòng)脈血栓形成法、腦動(dòng)脈血栓形成法、冠狀動(dòng)脈血栓形成、實(shí)驗(yàn)性肺栓塞和藥物引起血栓法及下腔靜脈血栓形成法等。抗血栓形成①針對(duì)血管內(nèi)皮損傷：血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，分別降脂實(shí)驗(yàn)高脂血癥動(dòng)物模型：1、高脂飼料喂養(yǎng)造模：不同動(dòng)物飼料有不同2、非喂養(yǎng)法誘發(fā)高脂血癥動(dòng)物模型免疫學(xué)方法；大鼠動(dòng)脈勻漿后，給兔子注射；馬血清給兔子注射；膽固醇-脂肪乳劑兔子耳緣靜脈注射等。血脂測定：總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白-膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、各型脂蛋白（HDL、LDL、VLDL）、載脂蛋白（apo，20多種）、低密度脂蛋白受體活性、LPO（脂質(zhì)過氧化物）降脂實(shí)驗(yàn)高脂血癥動(dòng)物模型：抗血栓、抗動(dòng)脈粥樣硬化血管內(nèi)皮細(xì)胞功能：

選擇性通透作用（引起膽固醇在血管壁沉淀，動(dòng)脈硬化）

抗血栓性（健康的血管內(nèi)腔面，不引起血小板粘附、聚集，釋放PGI2）

血管緊張的調(diào)節(jié)：血管舒張因子（EDRF)和血管收縮因子（EDCF）來實(shí)現(xiàn)。

毛細(xì)血管形成：血管內(nèi)皮細(xì)胞生長及形成毛細(xì)血管的過程與糖尿病增殖癥、網(wǎng)膜癥和實(shí)體癌癥的增殖、慢性炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)?？寡ā⒖箘?dòng)脈粥樣硬化血管內(nèi)皮細(xì)胞功能：

產(chǎn)生血細(xì)胞粘接因子：血管內(nèi)皮細(xì)胞表面因各種炎癥因子和變性的LDL的刺激，可產(chǎn)生各種細(xì)胞間粘附分子，引起白細(xì)胞、單核細(xì)胞、和血小板等于血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附，導(dǎo)致白細(xì)胞的血管外浸潤和動(dòng)脈粥樣硬化的初期病變。產(chǎn)生血細(xì)胞粘接因子：血管內(nèi)皮細(xì)胞表面因各種炎癥血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮舒張因子血管內(nèi)皮收縮因子內(nèi)皮素

實(shí)驗(yàn)方法血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷模型建立:

膽固醇損傷模型、氧化活性物質(zhì)損傷模型、DPPH（二苯三硝基苯肼，氧化劑）損傷模型、活體血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型（冰、腎上腺素刺激）分泌活性物質(zhì)的測定，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能的相關(guān)基因表達(dá)分析。血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮舒張因子血管平滑肌細(xì)胞研究1、血管壁生長控制平滑肌細(xì)胞的復(fù)制增加，DNA合成增強(qiáng)，內(nèi)皮完整性破壞，在平滑肌細(xì)胞增殖、AS形成中起重要作用。

2、血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)平滑肌細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)保護(hù)；分泌物質(zhì)（EDRF、PGI2、EDCF）調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的收舒功能。血管平滑肌細(xì)胞研究1、血管壁生長控制Ach引起依賴內(nèi)皮的平滑肌細(xì)胞舒張?jiān)恚?/p>

Ach作用于ECM（細(xì)胞外基質(zhì)）受體，引起精氨酸分解，產(chǎn)生NO------引起胞內(nèi)鈣離子水平下降（圖）

NO及超極化因子（EDHF）使平滑肌細(xì)胞超極化，胞內(nèi)鈣降低。前列環(huán)素（

PGI2）：升高細(xì)胞內(nèi)cGMP濃度，激活蛋白激酶A，使肌球蛋白脫磷酸化，舒張血管平滑肌。Ach引起依賴內(nèi)皮的平滑肌細(xì)胞舒張?jiān)恚撼Ｓ盟幮ШY選試驗(yàn)教程課件關(guān)于ASAS形成的主要特征之一是平滑肌細(xì)胞增生。AS發(fā)病因素有高血壓、缺氧、高膽固醇血癥及血液流變學(xué)、動(dòng)力學(xué)異常。除內(nèi)皮細(xì)胞核平滑肌細(xì)胞的相互作用外，血小板、白細(xì)胞、補(bǔ)體等也參與了AS的形成。如：高膽固醇可激活補(bǔ)體C5，促進(jìn)白細(xì)胞和血小板在血管啊內(nèi)皮細(xì)胞上聚集和粘附，致血流緩慢和通透性增高，引起血管內(nèi)皮損傷，導(dǎo)致生長因子釋放和單核細(xì)胞浸潤，促平滑肌細(xì)胞增生。關(guān)于ASAS形成的主要特征之一是平滑肌細(xì)胞增生。血管平滑肌細(xì)胞在抗AS藥物研究中的應(yīng)用正常的平滑肌細(xì)胞內(nèi)絲狀纖維占大部分，引起血管收縮和舒張，稱收縮型細(xì)胞。AS病灶內(nèi)的平滑肌細(xì)胞內(nèi)絲狀纖維明顯減少，小胞體和線粒體發(fā)達(dá)，細(xì)胞的增殖和游走能力亢進(jìn)，這種形態(tài)稱合成型。最新研究方法：用基因工程方法對(duì)血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)行肌漿球蛋白重鏈基因SM1導(dǎo)入后，觀察藥物對(duì)平滑肌細(xì)胞特異性的β-半乳糖酶活性，在體內(nèi)評(píng)價(jià)藥物的抗AS作用。體外，對(duì)經(jīng)形體轉(zhuǎn)換后的平滑肌細(xì)胞進(jìn)行特異性的β-半乳糖酶活性測定，篩選藥物。通過對(duì)合成型細(xì)胞分化誘導(dǎo)成收縮型平滑肌細(xì)胞，抑制平滑肌細(xì)胞的增殖和游走。開發(fā)：能使平滑肌細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)換的藥物。血管平滑肌細(xì)胞在抗AS藥物研究中的應(yīng)用正常的平滑肌細(xì)胞內(nèi)絲狀降壓實(shí)驗(yàn)高血壓模型

1、遺傳性高血壓模型：培育、自發(fā)性高血壓模型SHR、SHRSP、GH、SBH、MHS等。

2、神經(jīng)源性高血壓模型

3、腎動(dòng)脈狹窄性高血壓模型（兩側(cè)）

4、妊高征模型：子宮胎盤缺血模型（孕狗腹主動(dòng)脈鉗夾）

5、內(nèi)分泌模型：注射雄性激素14天，4毫克/天。降壓實(shí)驗(yàn)高血壓模型降壓試驗(yàn)檢測指標(biāo)血壓：血壓直接測定法、間接測定法（非創(chuàng)傷）離體血管環(huán)灌流心肌肥厚形態(tài)學(xué)指標(biāo)觀察：左心室重與體重的比值，左室壁厚度等。心室膠原含量和濃度測定：求羥脯氨酸含量。1克羥脯氨酸相當(dāng)于8.2克膠原蛋白。循環(huán)-內(nèi)分泌系統(tǒng)的指標(biāo)：血漿降鈣素基因相關(guān)肽、內(nèi)皮素、心鈉素腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)指標(biāo)NOS、NO檢測、血清細(xì)胞因子檢測（TNF、IL-1、IL-2等）降壓試驗(yàn)檢測指標(biāo)血壓：血壓直接測定法、間接測定法（非創(chuàng)傷）呼吸系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)（化痰止咳平喘藥）化痰試驗(yàn)：酚紅排泌法原理：酚酞和進(jìn)入的OH-發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，生成有紅色的物質(zhì)。用碳酸氫鈉沖洗氣管段，若酚紅排泌多，沖洗處的液體顏色深，比色后統(tǒng)計(jì)吸光度的差異。止咳實(shí)驗(yàn)：氨水引咳平喘試驗(yàn)：支氣管灌流、離體氣管條呼吸系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)（化痰止咳平喘藥）化痰試驗(yàn)：酚紅排泌法止咳實(shí)驗(yàn)：中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物實(shí)驗(yàn)

（安神藥、平肝熄風(fēng)藥）自發(fā)活動(dòng)觀察：吊籠法、曠野法、活動(dòng)儀睡眠實(shí)驗(yàn)：觀察指標(biāo)有潛伏期、睡眠時(shí)間（翻正反射消失時(shí)間）、睡眠發(fā)生率抗驚厥實(shí)驗(yàn)：觀察指標(biāo)有潛伏期、驚厥程度（半定量）、驚厥發(fā)生率、死亡率造模物質(zhì)：苯丙胺、回蘇靈、戊四氮、咖啡因、煙堿等。抗抑郁、抗躁狂：神經(jīng)遞質(zhì)檢測（NA\DA\5-HT)中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物實(shí)驗(yàn)

（安神藥、平肝熄風(fēng)藥）自發(fā)活動(dòng)觀察：吊缺血性心臟病藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)（開竅藥等）

一、藥物誘發(fā)心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ投⒐跔顒?dòng)脈阻斷、縮窄性心肌缺血和心肌梗死動(dòng)物模型三、心肌缺血再灌注損傷動(dòng)物模型四、心肌缺血性心臟血流動(dòng)力學(xué)動(dòng)物模型五、心肌缺血性冠脈循環(huán)動(dòng)物模型

六、心肌氧代謝動(dòng)物模型

七、體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺血樣損傷動(dòng)物模型

八、心肌細(xì)胞凋亡動(dòng)物模型缺血性心臟病藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)（開竅藥等）一、藥物誘發(fā)心肌缺血?jiǎng)游锟箲?yīng)激實(shí)驗(yàn)（補(bǔ)益藥）耐缺氧：常壓、低壓耐缺氧抗疲勞：游泳法、轉(zhuǎn)棒儀跑步法耐高溫：計(jì)數(shù)資料抗寒冷：抗輻射：抗應(yīng)激實(shí)驗(yàn)（補(bǔ)益藥）耐缺氧：常壓、低壓耐缺氧益智實(shí)驗(yàn)（補(bǔ)益藥）避暗實(shí)驗(yàn)：跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)：Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：定位航行實(shí)驗(yàn)、空間探索實(shí)驗(yàn)益智實(shí)驗(yàn)（補(bǔ)益藥）避暗實(shí)驗(yàn)：免疫系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)（補(bǔ)益藥等）免疫器官增重：脾臟、胸腺、法氏囊（禽類特有的免疫器官）免疫指標(biāo)：白細(xì)胞數(shù)量、吞噬功能（動(dòng)物碳廓清能力、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的能力）、補(bǔ)體、溶菌酶、干擾素含量等。免疫系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)（補(bǔ)益藥等）免疫器官增重：脾臟、胸腺、法氏囊（禽免疫試驗(yàn)指標(biāo)二硝基氟苯誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（通過T細(xì)胞、中性白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞引起的細(xì)胞損害）淋巴細(xì)胞數(shù)量（T、B）、轉(zhuǎn)化率ConA誘導(dǎo)的動(dòng)物脾淋巴細(xì)胞增殖能力動(dòng)物血清溶血素含量抗體生成細(xì)胞能力

NK細(xì)胞活性

白介素-2：是誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞DNA合成過程中促進(jìn)其生長增殖的重要因子經(jīng)綿羊紅細(xì)胞（SRBC）免疫動(dòng)物的淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生抗SRBC抗體（溶血素），并釋放至外周血。這種抗體在試管內(nèi)與SRBC溫育，在補(bǔ)體參與下可產(chǎn)生溶血反應(yīng)，免疫動(dòng)物血清中溶血素的含量可以通過溶血過程中釋放的血紅蛋白來測出。免疫試驗(yàn)指標(biāo)二硝基氟苯誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)經(jīng)綿羊紅細(xì)胞（NK細(xì)胞來源于骨髓，分布于淋巴結(jié)、脾臟和外周血，在機(jī)體防御及腫瘤監(jiān)視中起重要作用。NK細(xì)胞活化后即可釋放抗腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-2、干擾素γ（IFN-γ）等細(xì)胞因子，并呈正向調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能NK細(xì)胞來源于骨髓，分布于淋巴結(jié)、脾臟和外周血，在機(jī)體防御抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)移植性腫瘤整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法動(dòng)物：裸小鼠和C57BL/6小鼠

療效評(píng)價(jià)：

藥物對(duì)實(shí)體瘤的抑制率。

腫瘤抑制率=對(duì)照組瘤重-藥物組瘤重/對(duì)照組瘤重*100%

當(dāng)中藥的瘤重抑制率>30%時(shí)，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)，連續(xù)數(shù)次療效穩(wěn)定，統(tǒng)計(jì)有意義，再評(píng)價(jià)療效。也可測腫瘤體積。免疫缺陷，對(duì)異種移植不產(chǎn)生排斥。不用于初篩，價(jià)格高。黑毛，對(duì)藥物敏感性好，研究Lewis肺癌。多用于初篩治療期間給藥組小鼠死亡率>20%或平均體重下降（自身對(duì)照）超過15%，提示藥物有毒?？鼓[瘤作用實(shí)驗(yàn)移植性腫瘤整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法免疫缺陷，對(duì)異種移植不腹水瘤療效評(píng)價(jià)：對(duì)照組在2-3周內(nèi)死亡。藥物組觀察50天

生命延長率=治療組平均存活天數(shù)-對(duì)照組平均存活天數(shù)/對(duì)照組平均存活天數(shù)*100%

非ip給藥，生命延長率50%，ip給藥生命延長率75%，有苗頭，連續(xù)重復(fù)3次，療效穩(wěn)定，可結(jié)論。治療期間對(duì)照組動(dòng)物死亡≥

20%或其20%存活時(shí)間長于4周以上，實(shí)驗(yàn)均作廢。測量方法：每天稱重腹水瘤療效評(píng)價(jià)：治療期間對(duì)照組動(dòng)物死亡≥20%或其20%存抑制腫瘤增殖作用的體外試驗(yàn)方法體外細(xì)胞培養(yǎng)：藥效檢測、細(xì)胞毒性研究。

優(yōu)點(diǎn)：條件可控，直觀，經(jīng)濟(jì)，普篩，考察是直接作用或間接作用。缺點(diǎn)：內(nèi)外環(huán)境的巨大差別。評(píng)價(jià)指標(biāo)：藥物對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響、細(xì)胞膜功能的改變、克隆形成的減少、生長曲線的變化等。注意：單一指標(biāo)有不足之處，將幾種指標(biāo)結(jié)合起來研究，綜合評(píng)價(jià)。抑制腫瘤增殖作用的體外試驗(yàn)方法體外細(xì)胞培養(yǎng)：藥效檢測、細(xì)胞毒MTT法

又稱MTT比色法，是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。四氮唑（噻唑藍(lán)）MTT法又稱MTT比色法，是一種檢測細(xì)胞存活和生抑制誘癌作用的觀察

實(shí)驗(yàn)性腫瘤誘發(fā)：指用化學(xué)、物理、生物的致癌因子在動(dòng)物機(jī)體誘發(fā)出各種類型的腫瘤。用此類實(shí)驗(yàn)可驗(yàn)證可疑致癌因素，也可評(píng)價(jià)藥物對(duì)致癌因子的作用。誘癌模型建立要考慮的三條因素動(dòng)物對(duì)致癌物的敏感性動(dòng)物對(duì)致癌物劑量的反應(yīng)性動(dòng)物對(duì)飼養(yǎng)條件的反應(yīng)性（飼料中的營養(yǎng)成分影響誘發(fā)結(jié)果。維生素B2，影響奶油黃誘發(fā)肝癌）注意安全：實(shí)驗(yàn)環(huán)境通風(fēng)，給藥在通風(fēng)櫥內(nèi)，防護(hù)措施。抑制誘癌作用的觀察實(shí)驗(yàn)性腫瘤誘發(fā)：指用化學(xué)、物理、生物的常用的誘癌方法涂抹法誘發(fā)皮膚癌（背側(cè)或耳部皮膚），誘發(fā)上皮類腫瘤或二階段皮膚乳頭狀瘤。經(jīng)口給藥誘發(fā)胃癌（飲用或灌胃）體外誘癌模型建立

細(xì)胞培養(yǎng)---致癌物處理----棄掉致癌物培養(yǎng)液----癌化細(xì)胞的分離、克隆----細(xì)胞癌化的檢測。（形態(tài)、生長曲線、倍增時(shí)間、惡性度分析等）常用的誘癌方法涂抹法誘發(fā)皮膚癌（背側(cè)或耳部皮膚），誘發(fā)上皮類抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用實(shí)驗(yàn)頸動(dòng)脈注射方法移植癌細(xì)胞（血行性轉(zhuǎn)移）、肺轉(zhuǎn)移、皮下或肝轉(zhuǎn)移幾乎所有的臟器與組織的轉(zhuǎn)移模型都有報(bào)道人工轉(zhuǎn)移和自然轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞開發(fā)：腫瘤細(xì)胞不一定都具有轉(zhuǎn)移能力，形成了的腫瘤，也不一定具有轉(zhuǎn)移能力，可轉(zhuǎn)移的，轉(zhuǎn)移能力與轉(zhuǎn)移臟器的特異性也有別。選擇適合實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡哪[瘤細(xì)胞和方法。粘附是腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)以及腫瘤細(xì)胞之間通過特異性受體識(shí)別，結(jié)合并相互粘連的過程。轉(zhuǎn)移：從原發(fā)灶脫落---浸潤到靶目標(biāo)組織-----通過基底膜對(duì)基底膜的粘附-----造成基底膜構(gòu)成成分的破壞---把基底膜成分作為浸潤對(duì)象?？鼓[瘤轉(zhuǎn)移作用實(shí)驗(yàn)頸動(dòng)脈注射方法移植癌細(xì)胞（血行性轉(zhuǎn)移）、肺抑制腫瘤血管新生的實(shí)驗(yàn)方法雞胚尿囊膜血管新生觀察

血管生成抑制率=對(duì)照組血管面積-藥物組血管面積/對(duì)照組血管面積*100%抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增值，游走作用觀察

血管新生，首先是血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖（人的血管內(nèi)皮細(xì)胞是處于靜止期不增殖的）。腫瘤細(xì)胞分泌活性因子，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增生。觀察藥物對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、游走的作用。抑制腫瘤血管新生的實(shí)驗(yàn)方法雞胚尿囊膜血管新生觀察

腫瘤在沒有養(yǎng)分的供應(yīng)下，只能長到2～3立方毫米，一旦有新生血管與其相連，腫瘤獲得營養(yǎng)，就會(huì)以幾何級(jí)數(shù)迅速生長，同時(shí)腫瘤細(xì)胞還可以通過新生血管轉(zhuǎn)移到其他器官，引起腫瘤轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致人體死亡。因此，血管新生對(duì)腫瘤研究具有重要意義。腫瘤在沒有養(yǎng)分的供應(yīng)下，只能長到2～3立方毫米，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因素：細(xì)胞毒藥物激素、細(xì)胞因子、抗體、超抗原、粘附分子、免疫細(xì)胞、化療藥物、致癌物、生長因子缺失、高溫、放射線。

紫外線、γ射線導(dǎo)致DNA損傷引起細(xì)胞凋亡；激素對(duì)淋巴細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡作用(調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因)

細(xì)胞因子TNF可與某些靶受體上的TNF受體作用引起細(xì)胞凋亡；

細(xì)胞毒藥物，干擾腫瘤細(xì)胞生長、代謝、增殖等，誘導(dǎo)凋亡；微生物因素，細(xì)菌、病毒等致病微生物及毒素課誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。如HIV感染，可致大量CD/淋巴細(xì)胞凋亡。誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因素：細(xì)胞毒藥物激素、細(xì)胞因逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性作用腫瘤細(xì)胞耐藥分為：先天性耐藥和獲得性耐藥。耐藥機(jī)制：多藥耐藥基因MDR編碼的P-糖蛋白高表達(dá)。多藥轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（或P糖蛋白）：由人體多藥耐藥性基因編碼表達(dá)的能量依賴性藥物排出泵，能泵出有效天然的細(xì)胞毒藥物（多柔比星、柔紅霉素、長春新堿、長春堿、紫杉醇等）

多藥耐藥性：腫瘤細(xì)胞運(yùn)用多藥轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)方式引起的對(duì)抗腫瘤藥物的耐藥性稱“多藥耐藥性”。逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性作用腫瘤細(xì)胞耐藥分為：先天性耐藥和獲得性耐藥?！疤J薈逆轉(zhuǎn)食道癌細(xì)胞多藥耐藥性的實(shí)驗(yàn)研究

及機(jī)制探討”

研究背景：腫瘤細(xì)胞對(duì)多種化學(xué)藥物產(chǎn)生交叉耐藥性，稱“多藥耐藥”（MDR），是造成腫瘤化學(xué)藥物治療失敗的主要原因。統(tǒng)計(jì)表明，腫瘤年死亡率中，屬內(nèi)在性多藥耐藥的腫瘤，約占61%；屬獲得性多藥耐藥的腫瘤約占33%，因此，腫瘤耐藥與逆轉(zhuǎn)多藥耐藥成為腫瘤治療亟待解決的問題。本項(xiàng)課題的內(nèi)容是通過研究蘆薈大黃素（AloeEmodin，AE）對(duì)食道癌細(xì)胞株A549及A549/DDP的細(xì)胞毒性，確定蘆薈大黃素的無細(xì)胞毒性濃度；檢測此濃度的蘆薈大黃素能否逆轉(zhuǎn)A549/DDP株細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性，并初步探討其可能的機(jī)制?！疤J薈逆轉(zhuǎn)食道癌細(xì)胞多藥耐藥性的實(shí)驗(yàn)研究

及機(jī)制探討”一、研究方法如下：1、取對(duì)數(shù)生長期A549、A549/DDP細(xì)胞，設(shè)立蘆薈大黃素組：濃度為2.5μg·mL-1、5μg·mL-1、10μg·mL-1、15μg·mL-1、20μg·mL-1；陰性對(duì)照組：加培養(yǎng)液；溶劑對(duì)照組：0.1％二甲基（Diaminobenzidine，DMSO）和空白對(duì)照組：不加細(xì)胞。用MTT法檢測蘆薈大黃素對(duì)A549及A549/DDP細(xì)胞作用24h、48h、72h的細(xì)胞毒作用，確定蘆薈大黃素作用48h無細(xì)胞毒性濃度。2、用順鉑（濃度為：0.125μg·mL-1、0.25μg·mL-1、0.5μg·mL-1、1.0μg·mL-1、2.0μg·mL-1、4.0μg·mL-1、8.0μg·mL-1、16μg·mL-1、24μg·mL-1、32μg·mL-1）分別處理A549、A549/DDP細(xì)胞48h，MTT法檢測抑制效應(yīng)，并求出A549/DDP對(duì)DDP耐藥倍數(shù)。3、MTT法檢測無細(xì)胞毒性濃度蘆薈大黃素與順鉑（濃度為：0.125μg·mL-1、0.25μg·mL-1、0.5μg·mL-1、1.0μg·mL-1、2.0μg·mL-1、4.0μg·mL-1、8.0μg·mL-1、16μg·mL-1、24μg·mL-1、32μg·mL-1）聯(lián)用對(duì)A549/DDP的抑制效應(yīng)，求出蘆薈大黃素對(duì)A549/DDP耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。4、無細(xì)胞毒性濃度的蘆薈大黃素對(duì)A549/DDP株細(xì)胞生長曲線及倍增時(shí)間的影響。5、電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）法測定A549和A549/DDP細(xì)胞內(nèi)順鉑濃度，初步探討蘆薈大黃素逆轉(zhuǎn)多藥耐藥可能的作用機(jī)理。一、研究方法如下：

二、通過以上研究取得了以下研究成果：

1、MTT比色法結(jié)果顯示：AE可明顯抑制體外培養(yǎng)的A549株和A549/DDP株細(xì)胞的增殖，且抑制程度隨蘆薈大黃素作用時(shí)間和濃度的增加而增加，呈一定的時(shí)間、劑量（2.5-20μg·ｍL－1）依賴性，表明AE本身有細(xì)胞毒性作用，能抑制食道癌細(xì)胞的增殖；低于或等于5μg·mL-1的AE作用48h對(duì)A549和A549/DDP兩株細(xì)胞均無明顯毒性（IR<10%），將5μg·mL-1確定為AE的無細(xì)胞毒性濃度。

2、A549細(xì)胞的IC50為1.344μg·mL-1，A549/DDP細(xì)胞的IC50為16.81μg·mL-1，A549/DDP耐藥倍數(shù)為12.51倍；無細(xì)胞毒濃度（5μg·mL-1）AE與DDP合用時(shí)，A549/DDP細(xì)胞的IC50降為5.86μg·mL-1，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.87，說明AE增強(qiáng)了DDP對(duì)A549/DDP株細(xì)胞的殺傷作用，即與DDP合用時(shí)，能恢復(fù)DDP對(duì)A549/DDP細(xì)胞的敏感性，表明AE具有化療增敏作用，與細(xì)胞計(jì)數(shù)繪制生長曲線結(jié)果相一致。

3、電感偶合等離子質(zhì)譜法結(jié)果顯示：無細(xì)胞毒濃度（5μg·mL-1）AE與4μg·mL-1DDP合用后，能顯著增加A549/DDP株細(xì)胞內(nèi)DDP的積累，而未見顯著增加A549細(xì)胞內(nèi)DDP的積累。二、通過以上研究取得了以下研究成果：三、研究成果的科學(xué)意義和應(yīng)用前景研究發(fā)現(xiàn)AE對(duì)A549株和A549/DDP株細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用，且隨AE濃度及作用時(shí)間的增加而增加，生長抑制率呈藥物濃度-時(shí)間依賴方式。表明AE本身對(duì)兩株細(xì)胞有增殖抑制作用；在5μg·mL-1為AE的無細(xì)胞毒性濃度。此濃度的AE能明顯增強(qiáng)DDP對(duì)人食道癌細(xì)胞耐藥株A549/DDP增殖抑制作用，表明AE有部分逆轉(zhuǎn)A549/DDP細(xì)胞耐順鉑的作用且其逆轉(zhuǎn)耐藥的作用，與增加細(xì)胞內(nèi)藥物濃度有關(guān)。此研究結(jié)果表明蘆薈不僅具有抑制腫瘤的作用同時(shí)還具有抗MDR的作用，為進(jìn)一步開發(fā)蘆薈成為臨床多靶點(diǎn)抗腫瘤新藥提供了實(shí)驗(yàn)室的依據(jù)，為進(jìn)一步開發(fā)蘆薈提供了理論支持。三、研究成果的科學(xué)意義和應(yīng)用前景抗衰老、抗癡呆皮膚老化主要原因：ROS和過氧化脂質(zhì)等的過量導(dǎo)致皮膚細(xì)胞成分的損害。外源性的原因：紫外線、溫度、適度、環(huán)境污染等。判斷標(biāo)準(zhǔn)：皺紋，但內(nèi)在的是判定細(xì)胞老化的水平。研究部位：表皮的角化細(xì)胞或成纖維細(xì)胞。抗衰老、抗癡呆皮膚老化主要原因：ROS和過氧化脂質(zhì)等的過量導(dǎo)ROS

需氧細(xì)胞在代謝過程中產(chǎn)生一系列活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ROS)，包括：O2

-?、H2O2

及HO2?、?OH等。

中、高濃度的ROS通過細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡甚至導(dǎo)致其壞死。隨著自由基生物學(xué)研究的發(fā)展，研究者們逐漸認(rèn)識(shí)到ROS可雙向調(diào)控某些腫瘤細(xì)胞的凋亡和增殖，并發(fā)現(xiàn)了自由基與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)。最新研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的自由基能夠影響一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。機(jī)體內(nèi)的自由基通過其濃度調(diào)節(jié)著機(jī)體細(xì)胞的生死平衡，除了引起細(xì)胞凋亡、壞死的功能，低濃度的ROS更廣泛的生理意義在于其對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的激活以及對(duì)細(xì)胞增殖、分化的促進(jìn)。ROS需氧細(xì)胞在代謝過程中產(chǎn)生一系列活性氧簇(re抑制自由基作用的實(shí)驗(yàn)自由基損傷細(xì)胞的體外模型自由基測定：血清中過氧化脂質(zhì)、組織中過氧化脂質(zhì)、脂褐素、羥自由基、過氧化氫、超氧化物岐化酶氧化應(yīng)激相關(guān)基因NF-ΚB（核轉(zhuǎn)錄因子）的檢測當(dāng)細(xì)胞受到自由基作用，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，NF-ΚB向核內(nèi)移動(dòng)，與核內(nèi)基因序列上的特異性調(diào)控區(qū)結(jié)合，激活受調(diào)控的基因表達(dá)。抑制自由基作用的實(shí)驗(yàn)自由基損傷細(xì)胞的體外模型

清除自由基：

實(shí)驗(yàn)指標(biāo):SOD、MDA、LPO、MAO

脂褐素H2O2過氧化脂質(zhì)。自由基使脂質(zhì)發(fā)生過氧化作用而形成，使生物體內(nèi)細(xì)胞膜發(fā)生過氧化反應(yīng)受到損傷，引起疾病和老化。丙二醛，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物衰老的標(biāo)志，MDA與含游離氨基的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸交聯(lián)生成。過氧化脂質(zhì)。自由基使脂質(zhì)發(fā)生過氧化作用而形成，使生物體內(nèi)細(xì)胞抗皮膚衰老作用的實(shí)驗(yàn)方法

1.體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)皮膚組織的