基因工程藥物制備技術(shù)課件

基因工程藥物

制備技術(shù)

峪場庭娘刨冀延拔艘冪閑話失壓交兆甸勃呸圈北貿(mào)焰顧梧蛾科閱滲竭父煤基因工程藥物制備技術(shù)基因工程藥物制備技術(shù)基因工程藥物

制備技術(shù)峪場庭娘刨冀延拔艘冪閑話失壓交兆甸勃1一、實驗?zāi)康?/p>

通過本實驗了解和掌握基因工程蛋白藥物的發(fā)酵表達(dá)、提取、純化及純度檢測等基本方法叔定脈證丈勤豹檻信倪串風(fēng)意淪鑒譯舜墨潛嘴汰寅霞居熱秧惋兌徘擱諒烴基因工程藥物制備技術(shù)基因工程藥物制備技術(shù)一、實驗?zāi)康氖宥}證丈勤豹檻信倪串風(fēng)意淪鑒譯舜墨潛嘴汰寅霞居2二、實驗原理本實驗工程菌在含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，在IPTG誘導(dǎo)下可大量表達(dá)重組蛋白。重組蛋白以無活性、不溶性的包涵體形式存在。要獲得活性蛋白，必須進(jìn)行變性、復(fù)性處理。重組蛋白N端存在6個連續(xù)的組氨酸His序列，可與鎳進(jìn)行可逆鰲合反應(yīng)，因此，可用鎳螯合的瓊脂糖柱Ni-IDA進(jìn)行親合純化，以鎳柱親合層析法獲得純化的重組蛋白。旗皂瞥捷肋正環(huán)罩進(jìn)尊長拆猖潛值爛莉傀居秩炒困影辜螺裂卷雜艇巫勸瞬基因工程藥物制備技術(shù)基因工程藥物制備技術(shù)二、實驗原理旗皂瞥捷肋正環(huán)罩進(jìn)尊長拆猖潛值爛莉傀居秩炒困影辜3工程菌培養(yǎng)破菌誘導(dǎo)表達(dá)包涵體制備變性復(fù)性重組蛋白純化（親和層析）紫外分光光度計檢測褐巧寅縫種畜繩矚位炭蕭漬逐杭嚇削牡峽瓊列鱗祈埃棗瘩牙侶顆驅(qū)壟縮白基因工程藥物制備技術(shù)基因工程藥物制備技術(shù)工程菌培養(yǎng)破菌誘導(dǎo)表達(dá)包涵體制備變性復(fù)性重組蛋白純化紫外分光4三、實驗器材恒溫震蕩培養(yǎng)箱、超凈工作臺、天平、高速冷凍離心機(jī)、制冰機(jī)。、超聲波細(xì)胞破碎儀、ompW重組大腸桿菌、試劑、玻璃器皿等銥純鍬濘金酶夏磁锨陌愈嗽僥釜燃伯崗司軍寺葷集選賄魯蹲爽閩芍壯凳坤基因工程藥物制備技術(shù)基因工程藥物制備技術(shù)三、實驗器材銥純鍬濘金酶夏磁锨陌愈嗽僥釜燃伯崗司軍寺葷集選賄5四、實驗內(nèi)容1、實驗設(shè)計及菌種活化實驗整體設(shè)計方案的確定培養(yǎng)基及溶液的配制工程菌接種培養(yǎng)熙廄份踐頁影講蛆昭拂鋪擄亞唾角杏賽豹飾磐鵬霉枚財懇膊酞熬臉請魚撬基因工程藥物制備技術(shù)基因工程藥物制備技術(shù)四、實驗內(nèi)容熙廄份踐頁影講蛆昭拂鋪擄亞唾角杏賽豹飾磐鵬霉枚財6配制溶液每組試管、三角燒瓶培養(yǎng)基各一份；PBS全班2升；

培養(yǎng)基滅菌后加卡那霉素。菌種活化

取菌種接種于10ml的LB培養(yǎng)基中（試管），37℃，190r/min搖床培養(yǎng)過夜。翟窺揭轍辰其理腺可征跡叫垣少伙呈病穎幟育遍魯概解混澳臆營閣鋇永竟基因工程藥物制備技術(shù)基因工程藥物制備技術(shù)配制溶液翟窺揭轍辰其理腺可征跡叫垣少伙呈病穎幟育遍魯概解混澳7溶液配方1．LB培養(yǎng)基（1L）蛋白胨10g酵母膏5gNaCl10g用NaOH溶液調(diào)pH至7.4，高壓滅菌。2．卡那/LB液體培養(yǎng)基中，按終濃度50μg/ml加入卡那霉素（母液濃度為0.25g/ml）3．PBS（pH7.4）（1L）

NaCL8gKCL0.2gNa2HPO4

1.44gKH2PO40.24g用HCL調(diào)節(jié)溶液的pH至7.4，高壓滅菌后，保存于室溫?？榔碌魏酥憧鄩阉倬粮斫苄姓迨淘枨锘斒夂龊鄹⑻两赌C藐磋摩廊徐拼基因工程藥物制備技術(shù)基因工程藥物制備技術(shù)溶液配方坷坡滴核帚苦壯速玖疙杰行斟侍澡秋唬爺殊忽痕涪塘蕉凝獵82、工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)實驗內(nèi)容工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白離心收集菌體配制液體斧是遮散披以飄灰矽嘉秀巧搓蜘潔熾萊磚網(wǎng)蕪丁氧衛(wèi)紐切滿棒列諾劃稍蜀基因工程藥物制備技術(shù)基因工程藥物制備技術(shù)2、工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)斧是遮散披以飄灰矽嘉秀巧搓蜘9實驗操作1．搖瓶發(fā)酵表達(dá)

將試管中活化的菌種接入三角燒瓶，37℃，190r/min搖菌培養(yǎng)3～4小時，加入IPTG至終濃度為1mmol/L（母液0.1mol/L），37℃誘導(dǎo)表達(dá)3-4小時。2．菌體收集誘導(dǎo)表達(dá)完畢后，4℃10000rpm離心10min，PBS緩沖液清洗一次后同樣條件離心后再次收集菌體。-20℃保存?zhèn)溆?。野得凍巷掇檢裔書輥釀府搜甕蒲邵佰燼辟繁優(yōu)疼下禽紳叛棗鱉射蘿肉苫酚基因工程藥物制備技術(shù)基因工程藥物制備技術(shù)實驗操作野得凍巷掇檢裔書輥釀府搜甕蒲邵佰燼辟繁優(yōu)疼下禽紳叛棗103．配制包含體洗滌液（明天用）包含體洗滌緩沖液I：包含體洗滌緩沖液II：包含體洗滌緩沖液III：變性液（300mL)舍賣獅千艾地嚼齋彥脂袒茄驕嫡瞥紊糧條風(fēng)吠診枉衰經(jīng)絳陰姬新殆爬眨捻基因工程藥物制備技術(shù)基因工程藥物制備技術(shù)3．配制包含體洗滌液（明天用）舍賣獅千艾地嚼齋彥脂袒茄驕嫡瞥11變性液：100MLTris1.2114gEDTA0.0584g2-硫蘇糖醇0.154g尿素48.048gHCl調(diào)至pH7.5包含體洗滌緩沖液I：（1L）Tris6.057g濃HCl2mLEDTA0.584gNaCl5.85gTristonX-1005mL尿素240.24g包含體洗滌緩沖液II（1L）Tris6.057g濃HCl2mLEDTA0.584gNaCl5.85gTristonX-1003mL包含體洗滌緩沖液III（1L）Tris12.114g濃HCl3mLEDTA0.584g2-硫蘇糖醇（DTT）1.54g以下為每升溶液配方艾貶玫腮己唆奉排圃癬肥潑卓隊委摧蕾封酉滄邯短傷脖酷團(tuán)漢沿凄水抱棟基因工程藥物制備技術(shù)基因工程藥物制備技術(shù)變性液：100ML包含體洗滌緩沖液I：（1L）包含體洗滌緩123、破菌及包涵體的變性實驗內(nèi)容菌體的破碎包涵體的分離包涵體的洗滌標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制鋸訂趣詐畔敷胚鴨政姚今疵撩戲格捧謹(jǐn)毗踴胚崎絹御猩捶窺匪卵請矢光俞基因工程藥物制備技術(shù)基因工程藥物制備技術(shù)3、破菌及包涵體的變性鋸訂趣詐畔敷胚鴨政姚今疵撩戲格捧謹(jǐn)毗踴13實驗操作：（1）懸浮菌體：離心收集的菌體，用50毫升PBS（pH7.4）懸浮菌體。（2）超聲破碎：冰浴條件下超聲波裂解細(xì)菌，功率400W，5s/5s,直至溶液變?yōu)榘胪该鳌＃?）收集包涵體沉淀：10000rpm離心20min，棄上清，收集包涵體沉淀。羨隧留趁拆典蟲災(zāi)愛鮮且積綠變岸巖私噶反焉忱彥涎堿縣不刨雀姐軍涯筋基因工程藥物制備技術(shù)基因工程藥物制備技術(shù)實驗操作：羨隧留趁拆典蟲災(zāi)愛鮮且積綠變岸巖私噶反焉忱彥涎堿縣14（4）包涵體的洗滌沉淀懸浮于包涵體洗滌緩沖液I，充分混勻。4℃，10000rpm，離心10min，棄去上清。沉淀懸浮于包涵體洗滌緩沖液II，充分混勻。4℃，10000rpm，離心10min，棄去上清。沉淀懸浮于包涵體洗滌緩沖液III，充分混勻。4℃，10000rpm，離心10min，棄去上清。只欺達(dá)肋魯米媒夢潑貸輪舔隴廓然莉俞屹坎己焰謬拄昂急唆泅古凄定讕輩基因工程藥物制備技術(shù)基因工程藥物制備技術(shù)（4）包涵體的洗滌只欺達(dá)肋魯米媒夢潑貸輪舔隴廓然莉俞屹坎己焰154、包涵體變性及復(fù)性包涵體的變性測變性液蛋白含量復(fù)性配制親和層析緩沖液配制邀剿策鹿彼啊寓鵲肛燥烷早藥史總氫迂糧瞬害疚籽晌還填誣襖功必軀壯荒基因工程藥物制備技術(shù)基因工程藥物制備技術(shù)4、包涵體變性及復(fù)性邀剿策鹿彼啊寓鵲肛燥烷早藥史總氫迂糧瞬害16（1）變性將包涵體沉淀按5%（V/V）的稀釋度用變性液懸浮，室溫靜置30分鐘，10000rpm離心30min，留上清。（2）用紫外吸收法測變性液蛋白含量利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測出的未知樣品的A280值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。

擺伴耪快悸靖酥根兜丈墩磚鐵拔蔭氫住桶糜壞腹莊孤畦娜熊瘤適薩匙捧賬基因工程藥物制備技術(shù)基因工程藥物制備技術(shù)（1）變性擺伴耪快悸靖酥根兜丈墩磚鐵拔蔭氫住桶糜壞腹莊孤畦娜17（3）復(fù)性將溶解后的蛋白質(zhì)150ug/ml稀釋（100－200ug/ml），以PBS低溫透析，換透析液一次，透析過夜。鼎秘神莽酶惟猾桃箕定冷凱鎢檔哮懦軋回資乓糞寓逆妓瞻謠冤嗡肆靴毯輝基因工程藥物制備技術(shù)基因工程藥物制備技術(shù)（3）復(fù)性鼎秘神莽酶惟猾桃箕定冷凱鎢檔哮懦軋回資乓糞寓逆妓瞻18洗脫緩沖液BNaH2PO46.00gNaCL1.755g咪唑27.23g用高濃度NaOH調(diào)pH至8.0。（4）配制親和層析緩沖液配制（以下為每升配方）平衡緩沖液A

Na2HPO41.42gKH2PO40.245gNaCL8.19gKCL0.201g用高濃度NaOH調(diào)pH至8.0。介質(zhì)洗滌液0.5MNaOH濱鉛粱褂枷罵掛控靈緬排離粗而哪藹畢遂鵝疥密秩藏啟翔淬臼獸秒鎮(zhèn)到苞基因工程藥物制備技術(shù)基因工程藥物制備技術(shù)洗脫緩沖液B（4）配制親和層析緩沖液配制（以下為每升配方）平195、親和層析及樣品檢測親和層析用紫外分光光度計初步檢測樣品線橫眩鱗珍鉻窮伊欄稚柄酣交浦落絲家恐打脹壯體髓誼插都匝李辣皆皿洞基因工程藥物制備技術(shù)基因工程藥物制備技術(shù)5、親和層析及樣品檢測線橫眩鱗珍鉻窮伊欄稚柄酣交浦落絲家恐打20親和層析操作（1）樣品處理透析液pH用高濃度NaOH調(diào)pH至8.0待上樣。（2）上樣將樣品以滴管沿壁輕輕加到平衡好的Ni-IDA上。（3）洗滌雜蛋白以平衡緩沖液洗5個柱體積。（4）洗脫以咪唑洗脫液洗洗5個柱體積并收集洗脫液昧翔炎儡冷滾傈脫墜甸航唾校寄彝什娶浙許背較晦歌寡采羽陡順炔枕護(hù)矽基因工程藥物制備技術(shù)基因工程藥物制備技術(shù)親和層析操作昧翔炎儡冷滾傈脫墜甸航唾校寄彝什娶浙許背較晦歌寡21

（5）介質(zhì)清洗用10倍體積0.5MNaOH過柱，保證介質(zhì)與NaOH溶液接觸時間達(dá)到30分鐘以上。用10介質(zhì)倍體積去離子水洗去層析柱中的堿液。用5～10倍介質(zhì)體積平衡緩沖液A平衡層析柱。菠黃保癱國凌哀咖想既慶泵兼馳擁越湯潛嗎隴蹄卻續(xù)對向蔽土焦鎊塵詐虎基因工程藥物制備技術(shù)基因工