毛細管電泳課件

3.10.1概述1.電泳：在外加電場的影響下，帶電的膠體粒子或離子在介質(zhì)中作定向移動的現(xiàn)象稱為電泳。2.不同帶電粒子的電荷量和分子大小不同，流動速率也不同，因此電泳是一種適用于膠體粒子和離子的分析分離技術(shù)。電泳現(xiàn)象早在十九世紀初就已發(fā)現(xiàn)（1808年俄國物理學家Re?ss進行了世界上第一次電泳實驗）。但電泳技術(shù)的廣泛應用，則是在1937年用濾紙作為支持介質(zhì)成功地進行紙電泳以后，特別是近幾十年以來，電泳技術(shù)發(fā)展很快，各種類型的電泳技術(shù)相繼誕生，在生物化學、醫(yī)學、免疫學等領(lǐng)域得到了廣泛應用。原則上按電泳的原理來分，可分為二類：自由界面電泳：又稱移動界面電泳，是指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進行的電泳。其裝置復雜，價格昂貴，費時費力，不便于推廣應用。區(qū)帶電泳：是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用主要是防止電泳過程中的對流和擴散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶電泳由于采用的介質(zhì)不同以及技術(shù)上的差異，又可分為不同的類型。

電泳的分類按支持介質(zhì)種類的不同，區(qū)帶電泳可分為：①紙電泳：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。②醋酸纖維素薄膜電泳：醫(yī)學上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，其優(yōu)點是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。以上二種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效應，主要靠被分離物的電荷多少進行分離。③淀粉凝膠電泳：多用于同工酶分析，凝膠鋪厚些，可一層一層剝層分析（一板多測）。天然淀粉經(jīng)加工處理即可使用，但孔徑度可調(diào)性差，并且由于其批號之間的質(zhì)量相差很大，很難得到重復的電泳結(jié)果，加之電泳時間長，操作麻煩，分辨率低，實驗室中已很少使用。④瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應。⑤聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測。其分辨率較高。聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實驗室最常用的支持介質(zhì)另外根據(jù)支持介質(zhì)形狀不同，區(qū)帶電泳可分為：薄層電泳、板電泳、柱電泳。據(jù)用途不同，可分為：分析電泳、制備電泳、定量、免疫電泳。電泳技術(shù)的特點凡是帶電物質(zhì)均可應用某一電泳技術(shù)進行分離,并可進行定性或定量分析;樣品用量極少;設(shè)備簡單;可在常溫進行;操作簡便省時;分辨率高;特別適合于蛋白、核酸等大分子物質(zhì)的分離。是生化藥物、基因工程藥物分析的重要手段。毛細管電泳（CE）毛細管電泳（CE）又稱高效毛細管電泳（HPCE）或毛細管電分離法（CESM），是一類以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動力的新型液體分離分析技術(shù)。毛細管電泳實際上包括電泳、色譜及其交叉內(nèi)容，是分析科學中繼高效液相色譜之后的又一重大進展，它使分析科學得以從微升水平進入到納升水平，并使單細胞分析，乃至單分子分析稱為可能。高效毛細管電泳（HPCE）高效毛細管電泳（HPCE）是近年來發(fā)展起來的一種高效、快速的分離分析技術(shù)，是經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的產(chǎn)物。HPCE已成為一種重要的分離分析方法，在生物、醫(yī)藥、化工、環(huán)保、食品等領(lǐng)域具有廣闊的應用前景。3.10.2高效毛細管電泳的理論基礎(chǔ)1.經(jīng)典電泳與高效毛細管電泳區(qū)別（1）經(jīng)典電泳分離法的不足所用分離柱的柱徑大，柱較短，分離效率不高（遠低于HPLC），溫度影響大。高效毛細管電泳在技術(shù)上采取了兩項重要改進。（2）高效毛細管電泳在技術(shù)上采取了兩項重要改進：一是采用了0.05mm內(nèi)徑的毛細管,；二是采用了高達數(shù)千伏的電壓。毛細管的采用使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應，使電場電壓可以很高。電壓升高，電場推動力大，又可進一步使柱徑變小，柱長增加，高效毛細管電泳的柱效遠高于高效液相色譜，理論塔板數(shù)高達幾十萬塊/米，特殊柱子可以達到數(shù)百萬。2.電泳現(xiàn)象與電滲流現(xiàn)象電泳：在電解質(zhì)溶液中，帶電粒子在電場作用下，以不同速度向其所帶電荷相反方向遷移的現(xiàn)象稱為電泳。電滲流（electroosmoticflow，EOF）：指管內(nèi)溶液在外力電場作用下整體向一個方向運動的現(xiàn)象。HPCE通常采用的是石英毛細管柱，一般情況下（pH＞3），硅醇基（—SiOH）電離為硅氧基負離子（—SiO），使管壁表面帶負電，為了保持電荷平衡，溶液中水合離子（一般為陽離子）被吸附到表面附近，形成雙電層。當在毛細管兩端加高電壓時，雙電層中的陽離子向陰極移動，由于離子是溶劑化的，所以帶動了毛細管中溶液整體向陰極移動，產(chǎn)生電滲流。在不少情況下，電滲流的速度是電泳流速度的5～7倍。3.分離過程

電場作用下，柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流兩種速度的矢量和。正離子：兩種效應的運動方向一致，在負極最先流出；中性粒子無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出；陰離子：兩種效應的運動方向相反，ν電滲流>ν電泳時,陰離子在負極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,除中性粒子外,同種類離子由于受到的電場力大小不一樣也同時被相互分離。正離子的運動方向和電滲流一致，因此最先流出；中性粒子的電泳流速度為“零”，其移動速度相當于電滲流速度；而負離子的運動方向和電滲流方向相反，但因電滲流速度一般都大于電泳流速度，故它將在中性粒子之后流出，因而各種粒子因差速遷移而分離。分離方式的優(yōu)點：所有正負離子和中性分子都向同一個方向遷移，因此可在柱末端放置檢測器實現(xiàn)在線檢測。4.分離方程粒子的電泳速率由下式?jīng)Q定：其中E為電場強度，μep為兩溶質(zhì)的平均電泳淌度，即離子在給定介質(zhì)中單位時間和單位場強下移動的距離，淌度的大小與粒子的凈電荷、半徑及介質(zhì)黏度等相關(guān)。溶液中同時存在泳流和滲流，在不考慮相互作用的前提下，粒子在毛細管內(nèi)電解質(zhì)中的運動速度應當是電泳流速度（）和電滲流速度（）的矢量和，即式中，μeo為電滲淌度，V為外加電壓，L為毛細管總長度。理論塔板數(shù)n為：式中D為擴散系數(shù)，分離度R為μ1，μ2分別為相鄰兩溶質(zhì)的電泳淌度，μep為兩溶質(zhì)的平均電泳淌度。在HPCE中電滲流的一個重要特點是具有平面流型，電滲的驅(qū)動力沿毛細管均勻分布，它使整個流體象一個塞子一樣以均勻的速度向前運動。而在HPLC中流體流型則是拋物線型的層流，其中心處速度是平均速度的2倍。電滲流的平面流型和HPLC中高壓泵驅(qū)動所產(chǎn)生的拋物線型層流的速度曲線不同，不會直接引起樣品組分區(qū)帶在柱內(nèi)擴張，這是HPCE獲得高效分離的重要原因之一。5.HPCE的特點優(yōu)點：1.高靈敏度：采用電化學檢測器，最低檢測限可達10-19mol；2.高效：HPCE每米理論塔板數(shù)為幾十萬，高者可達幾百萬甚至幾千萬；3.高速：通常的分析時間不超過30min。有1.7min內(nèi)分離19種陽離子及3min內(nèi)分離30種陰離子的報道；4.樣品用量少：只需nL（109L）級；5.低消耗：每次分析只需少量（幾毫升）流動相，分析過程是在價格低廉的毛細管柱中進行；6.應用范圍廣：從簡單的無機離子、有機離子到整個細胞，都可進行分離分析。具有“萬能”分析功能或潛力。不足之處：進樣不夠方便。應用范圍相對較窄。分析陰離子時，由陰極進樣，在陽極檢測。但電滲流方向與陰離子受電場力作用移動方向相反，出峰時間較長。6.影響柱效的因素及改進方法熱效應：焦耳熱仍是影響柱效的主要因素。采用外部冷卻的方法散熱，擇合適的電壓和電解質(zhì)也是提高柱效的有效途徑。選擇合適的電解質(zhì)降低電阻，電流低于200微安，一般幾十微安。電滲流控制：電滲流的大小和方向依賴于毛細管壁與溶液間電勢的極性和大小。使用添加劑可以改變電滲流的大小和方向，如添加NaCl和甲醇可降低電滲流；加入乙腈則可以增大電滲流。加入反轉(zhuǎn)劑。則可以改變電滲流的方向。3.10.3高效毛細管電泳儀器電壓：0～30KV。分離柱不涂敷任何固定液，紫外或激光誘導熒光檢測器（可檢測到：10-19～10-21mol/L）毛細管的特點檢測器由于HPCE采用了極小內(nèi)徑的毛細管，進樣量很小，因此只有具有高靈敏度的檢測器，才能進行定性、定量分析。檢測器是HPCE儀的關(guān)鍵部件。HPCE檢測器中應用較廣泛的是紫外-可見檢測器和電化學檢測器。迄今為止，除了原子吸收光譜、電感耦合等離子體發(fā)射光譜（ICP）及紅外光譜未用于HPCE外，熒光、電化學、質(zhì)譜、激光類和其他類型檢測器（如折射率檢測器、同位素檢測器等）均已應用。3.10.4高效毛細管電泳的分離模式1.毛細管區(qū)帶電泳(CZE)2.毛細管凝膠電泳(CZE)3.膠束電動毛細管色譜（MECC或MEKC）4.毛細管等電聚焦(CIEF)5.毛細管等速電泳（CITP）6.毛細管電滲色譜1.毛細管區(qū)帶電泳

capillaryzoneelectrophoresis，CZE

帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流速度的矢量和。

正離子：兩種效應的運動方向一致，在負極最先流出；中性粒子：無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出；

陰離子：兩種效應的運動方向相反；ν電滲流>ν電泳時,陰離子在負極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,同種類離子由于差速遷移被相互分離。

最基本、應用廣的分離模式；2.毛細管凝膠電泳

capillarygelelectrophoresis，CGE

將聚丙烯酰胺等在毛細管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分擴散，所得峰型尖銳，分離效率高。蛋白質(zhì)、DNA等的電荷/質(zhì)量比與分子大小無關(guān)，CZE模式很難分離，采用CGE能獲得良好分離，DAN排序的重要手段。特點：抗對流性好，散熱性好，分離度極高。無膠篩分技術(shù)：采用低粘度的線性聚合物溶液代替高粘度交聯(lián)聚丙烯酰胺。柱便宜、易制備。

1.緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度達到臨界濃度，形成一疏水內(nèi)核、外部帶負電的膠束。3.膠束電動毛細管色譜（MECC，MEKC）

micellarelectrokineticcapillarychromatography，MEKC

在電場力的作用下，膠束在柱中移動。

2.電泳流和電滲流的方向相反，且ν電滲流

>ν電泳，負電膠束以較慢的速度向負極移動；

5.色譜與電泳分離模式的結(jié)合。

3.中性分子在膠束相和溶液（水相）間分配，疏水性強的組分與膠束結(jié)合的較牢，流出時間長；

4.可用來分離中性物質(zhì)，擴展了高效毛細管電泳的應用范圍；

1.根據(jù)等電點差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術(shù)；2.毛細管內(nèi)充有兩性電解質(zhì)（合成的具有不同等電點范圍的脂肪族多胺基多羧酸混合物），當施加直流電壓（6～8V）時，管內(nèi)將建立一個由陽極到陰極逐步升高的pH梯度；3.氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽等的所帶電荷與溶液pH有關(guān)，在酸性溶液中帶正電荷，反之帶負電荷。在其等電點時，呈電中性，淌度為零；4.毛細管等電聚焦

capillaryisoelectricfocusing，CIEF

4.聚焦：具有不同等電點的生物試樣在電場力的作用下遷移，分別到達滿足其等電點pH的位置時，呈電中性，停止移動，形成窄溶質(zhì)帶而相互分離；

5.陽極端裝稀磷酸溶液，陰極端裝稀NaOH溶液；

6.加壓將毛細管內(nèi)分離后的溶液推出經(jīng)過檢測器檢測；

7.電滲流在CIEF中不利，應消除或減小。

1.將兩種淌度差別很大的緩沖液分別作為前導離子(充滿毛細管)和尾隨離子，試樣離子的淌度全部位于兩者之間，并以同一速度移動。

2.負離子分析時，前導電解質(zhì)的淌度大于試樣中所有負離子的。所有試樣都按前導離子的速度等速向陽極前進，逐漸形成各自獨立的區(qū)帶而分離。陰極進樣，陽極檢測。5.毛細管等速電泳

capillaryisotachophoresis，CITP

3.不同離子的淌度不同，所形成區(qū)帶的電場強度不同(ν=μE)，淌度大的離子區(qū)帶電場強度小；沿出口到進口，將不同區(qū)帶依次排序1、2、3、4電場強度依次增大。假設(shè)“2”號中離子擴散到“3”號，該區(qū)電場強度大，離子被加速，返回到“2”區(qū)；當“2”號中離子跑到“1”號區(qū)，離子被減速使之歸隊；4.特點：界面明顯，富集、濃縮作用；capillaryisotachophoresis，CITP(1)在毛細管壁上鍵合或涂漬高效液相色譜的固定液，以電滲流為流動相，試樣組分在兩相間的分配為分離機理的電動色譜過程.(2)這種方式將HPLC發(fā)展的固定相引入到CE中，增加了選擇性，但又保持了CE的固有優(yōu)點，是一種有發(fā)展前景的分離模式。6.毛細管電滲色譜

capillaryelectroosmosticchromatography，CEC3.10.5應用與進展1.離子分析2.藥物分析3.手性化合物分析4.氨基酸與蛋白質(zhì)分析5.核酸分析及DNA排序6.新進展

1.

離子分析

analysisofion陽離子分析

遷移方向和電滲流方向一致；

4.5min內(nèi)分離了24種金屬離子；陽極進樣，陰極檢測；具有很高的靈敏度；陰離子分析陰離子電泳方向和電滲流方向相反、速度接近，分析時間長、效率低；質(zhì)量小、電荷密度大的離子如：SO4-2、Cl-、F-等，電泳速率大于電滲流，陽極端流出，在陰極端無法檢測；加入電滲流改性劑，十六烷基三甲基溴化胺等，使電泳方向和電滲流方向一致，可在3.1min內(nèi)分離36種陰離子；陰極進樣，陽極檢測；離子價態(tài)及存在形態(tài)分析；2.藥物分析

analysisofpharmaceutics

檢測體液或細胞中某些代謝產(chǎn)物的分析；尿液中的氨基酸含量作為臨床診斷糖尿病的輔助手段；采用毛細管區(qū)帶電泳方式，在11min內(nèi)分離17種藥物；采用MEKC模式，鑒定違禁藥物；效果優(yōu)于HPLG法3.手性化合物分析

analysisofchira