單雙波長(zhǎng)的使用

單雙波長(zhǎng)的使用第1頁，課件共17頁，創(chuàng)作于2023年2月概念

波長(zhǎng)：是在空間或者沿著導(dǎo)線傳輸?shù)囊粋€(gè)波形信號(hào)中，相鄰周期且同樣端點(diǎn)之間的距離。

單波長(zhǎng)：就是使用一種對(duì)顯色具有最大吸收的波長(zhǎng)即450或492進(jìn)行比色測(cè)定。雙波長(zhǎng)：除了用對(duì)顯色具有最大吸收的波長(zhǎng)外，同時(shí)對(duì)特異性顯色不敏感的波長(zhǎng)如630nm進(jìn)行測(cè)定。

第2頁，課件共17頁，創(chuàng)作于2023年2月第3頁，課件共17頁，創(chuàng)作于2023年2月問題一問：酶標(biāo)儀常用波長(zhǎng)有那些？答：不同型號(hào)的酶標(biāo)儀安裝的濾光片不一樣。如：BIO-RAD-550標(biāo)準(zhǔn)波長(zhǎng)：405、450、490、655也可選用400~700nmMK3標(biāo)準(zhǔn)波長(zhǎng)：405、450、492、630也可選用340~750nm結(jié)合工作中實(shí)際情況合理的選擇酶標(biāo)儀型號(hào)第4頁，課件共17頁，創(chuàng)作于2023年2月問題二問：為什么試驗(yàn)中的常用波長(zhǎng)是450或492nm，少部分是405,而不是其他的波長(zhǎng)？答：1.了解市場(chǎng)

2.特定波長(zhǎng)：在特定條件下測(cè)定每一種物質(zhì)都有其特定的波長(zhǎng)，在此波長(zhǎng)下，此物質(zhì)能夠吸收最多的光能量。如果選擇其它的波長(zhǎng)段，就會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確。因此，在測(cè)定檢測(cè)物時(shí)，我們選擇特定的波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，稱為測(cè)量波長(zhǎng)

第5頁，課件共17頁，創(chuàng)作于2023年2月問題二3.學(xué)習(xí)兩個(gè)原理

3.1.TMBDAB+聯(lián)苯醌（在450nm處有最大的消光系數(shù)）So:ELISA中，底物反應(yīng)顯色后，常選擇其具最大吸收的波長(zhǎng)450比色測(cè)定結(jié)果。3.2.pNPPpNP（在405nm處有最大的消光系數(shù)）HRP\H2O2AP第6頁，課件共17頁，創(chuàng)作于2023年2月問題三

問：為什么有的波長(zhǎng)需要添加一個(gè)副波長(zhǎng)？而且常用的是630nm？答：1.Madersbacher和Berger做了個(gè)實(shí)驗(yàn)首先是用450和405測(cè)定一系列的已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)本品，證實(shí)450/405Z之比為3.2;其次用405測(cè)定很低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的OD值再乘以常熟3.2，即為待測(cè)樣本在波長(zhǎng)450的值。第7頁，課件共17頁，創(chuàng)作于2023年2月問題三

證明：雙波長(zhǎng)測(cè)定可以提高ELISA的敏感度。2.每一種物質(zhì)對(duì)光能量還存在一定的非特異性吸收，為了消除這種非特異性吸收，我們?cè)龠x取一個(gè)參照波長(zhǎng)，以消除這個(gè)不準(zhǔn)確性。在參照波長(zhǎng)下，檢測(cè)物光的吸收最小。檢測(cè)波長(zhǎng)和參照波長(zhǎng)的吸光值之差可以消除非特異性吸收。3.630nm下得到的吸光度是非特異性，主要來時(shí)于板塊上諸如指紋、灰塵，贓物等所致的吸收。

第8頁，課件共17頁，創(chuàng)作于2023年2月問題四問：雙波長(zhǎng)測(cè)定時(shí)OD結(jié)果是如何計(jì)算得出的？答：樣本值=敏感值-非敏感值敏感波上下的吸光度測(cè)定值為樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和；非敏感波長(zhǎng)下測(cè)定即改變波長(zhǎng)至一定值，使得樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度值為零，此時(shí)測(cè)得的吸光度即為臟物的吸光度值。第9頁，課件共17頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)分析1第10頁，課件共17頁，創(chuàng)作于2023年2月問題五問:單波長(zhǎng)測(cè)定的干擾因素有那些？答：1.內(nèi)源性干擾包括噪音、漂移、電壓等

2.表面張力的影響

3.重復(fù)性差第11頁，課件共17頁，創(chuàng)作于2023年2月問題六問:雙波長(zhǎng)測(cè)定的優(yōu)點(diǎn)？1.一般不必設(shè)空白孔。仍設(shè)空白孔，就可能會(huì)出現(xiàn)負(fù)值。2.能排除由微滴板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對(duì)特異顯色測(cè)定吸光度的影響的優(yōu)點(diǎn)。3.重復(fù)性好。第12頁，課件共17頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)分析2刮花前刮花前刮花后刮花后第13頁，課件共17頁，創(chuàng)作于2023年2月總結(jié)現(xiàn)象：1.單雙的結(jié)果差異比較大2.刮花對(duì)雙波長(zhǎng)的影響比較的小討論：結(jié)論：運(yùn)用雙波長(zhǎng)不會(huì)影響靈敏度，反而會(huì)減少其他因素的干擾。建議酶免法測(cè)定使用雙波長(zhǎng)，這樣可以提高臨界值附近樣本結(jié)果判斷的準(zhǔn)確度，減少實(shí)驗(yàn)誤差。第14頁，課件共17頁，創(chuàng)作于2023年2月波長(zhǎng)選擇原理

1.首先要確定顯色液的最大吸收峰

聯(lián)苯聯(lián)苯醌：450nm甲苯、二甲苯：465nm硝基酚：405nm2.結(jié)合試劑說明書選擇波長(zhǎng)

用酶標(biāo)儀單波長(zhǎng)450nm或雙波長(zhǎng)450nm/630nm測(cè)定各孔OD值（用單波長(zhǎng)測(cè)定時(shí)需用空白對(duì)