第六章-常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用課件

第六章常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用Thepopulartechnologyinmolecularbiology:

principleandapplication第六章常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用1第一節(jié)分子生物學(xué)發(fā)展概述第一節(jié)分子生物學(xué)發(fā)展概述2分子生物學(xué)molecularbiology是在分子水平上研究生物的結(jié)構(gòu)、組織和功能的科學(xué)。1950年，Astbury在一次學(xué)術(shù)報告中，首次提出并使用了分子生物學(xué)這一名詞術(shù)語。醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)是應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)和理論來闡明人體正常生理活動和病理過程及其調(diào)控的分子機理的一門科學(xué)。概述分子生物學(xué)molecularbiology是在分子水平上研3一、分子生物學(xué)一些重要的理論知識1.分子生物學(xué)發(fā)展史上一些重要的事件（1）1865年，“遺傳學(xué)之父”G.Mendel根據(jù)豌豆雜交試驗結(jié)果，創(chuàng)立了遺傳因子學(xué)說，即遺傳的分離律和自由組合律。（2）1903年W.Sutton提出染色體是Mendel遺傳單位的載體的概念。（3）1909年，W.Johannsen將這種在染色體上的遺傳單位定名為基因（gene）。一、分子生物學(xué)一些重要的理論知識1.分子生物學(xué)發(fā)展史上一些重4（4）1910年，現(xiàn)代實驗遺傳學(xué)奠基人TH.Morgan和他的研究生在研究果蠅的遺傳規(guī)律時發(fā)現(xiàn)了基因的連鎖律和交換律。（5）1944年，OT.Avery等人（3人）分離出細(xì)菌DNA，并發(fā)現(xiàn)DNA是攜帶生命遺傳物質(zhì)的分子。（6）1950年，Astbury在一次演講中，首次使用了“分子生物學(xué)”術(shù)語。（4）1910年，現(xiàn)代實驗遺傳學(xué)奠基人TH.Morgan和他5（7）1953年，Watson和Crick提出了DNA結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型，揭示了遺傳物質(zhì)自我復(fù)制的機制。

（8）1961年至1966年，Nirenberg和Crick等人破譯了DNA遺傳密碼，1966年破譯了64個遺傳密碼。提出了遺傳信息由DNA→RNA→蛋白質(zhì)傳遞的中心法則。

（9）1969年，JonathanBeckwith及其同事在哈佛大學(xué)成功分離出第一個基因。（7）1953年，Watson和Crick提出了DNA結(jié)構(gòu)的6（10）1961年，F(xiàn).Jacob和J.Monod提出了乳糖操縱子學(xué)說。（11）1970年，發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶。（12）自1946年起的20年當(dāng)中，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了許多質(zhì)粒；1968年至1970年又發(fā)現(xiàn)了許多限制性內(nèi)切酶，為DNA體外重組提供了有利工具。（13）1973年，重組DNA技術(shù)問世。（14）1986年，K.Mullis等建立了PCR技術(shù)（15）1990年，人類基因組計劃。（10）1961年，F(xiàn).Jacob和J.Monod提出了乳7DNA的結(jié)構(gòu)、復(fù)制、中心法則基本構(gòu)成單位是核苷酸核苷酸由脫氧核糖、堿基和磷酸構(gòu)成。堿基分別是腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)。相鄰的兩個核苷酸以磷酸二酯鍵相連進(jìn)一步盤旋、折疊，形成三級或四級結(jié)構(gòu)

2.一些重要理論importanttheoryDNA的結(jié)構(gòu)、復(fù)制、中心法則2.一些重要理論importa8五碳糖為核糖(不是脫氧核糖)；堿基中有尿嘧啶U(uracil)而沒有胸腺嘧啶RNA為單鏈，不是雙鏈，但RNA單鏈之間相鄰的堿基可由氫鍵作用形成局部雙鏈。DNA存在于細(xì)胞核的染色體、線粒體以及染色體以外的質(zhì)粒中(質(zhì)粒是一些雙鏈，閉環(huán)的DNA分子)。RNA與DNA有如下不同點：RNA與DNA有如下不同點：9

DNA(或RNA)結(jié)構(gòu)給我們的啟示①DNA(或RNA)是水溶性的。這是由于含有磷酸基因、羥基和氨基。在核酸提取過程中，我們保留的是水相、而不是有機相。②核酸是兩性電離，既帶正電荷，又帶負(fù)電荷。它的等電點(PI)為2～2.5。在中性溶液中帶負(fù)電荷。對核酸進(jìn)行電泳時，點樣時應(yīng)點在負(fù)極；雜交時選擇尼龍膜時，最好選擇帶正電荷的尼龍膜。(核酸帶負(fù)電荷，容易吸附到帶正電荷的膜上，牢固，不掉)

DNA(或RNA)結(jié)構(gòu)給我們的啟示10③DNA在細(xì)胞中存在部位不同(細(xì)胞核、線粒體、質(zhì)粒)，所以應(yīng)注意提取方法的不同

④由于DNA空間構(gòu)象不同，在電泳時遷移率不同。⑤根據(jù)堿基互補配對原則，可設(shè)計引物和探針雜交。⑥由于DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)和RNA易由于分子內(nèi)氫鏈作用形成二級結(jié)構(gòu)，所以在進(jìn)行雜交等反應(yīng)時，首先應(yīng)加熱變性，破壞二級結(jié)構(gòu)。③DNA在細(xì)胞中存在部位不同(細(xì)胞核、線粒體、質(zhì)粒)，所以應(yīng)11

在解旋酶的作用下，打開DNA雙鏈在特定的復(fù)制起始點以每條DNA鏈為模板在DNA聚合酶的催化下以4種脫氧核苷酸為前體物，合成一條互補DNA鏈。DNA的復(fù)制稱為半保留復(fù)制。DNA的復(fù)制在解旋酶的作用下，打開DNA雙鏈DNA的復(fù)制12DNA半不連續(xù)復(fù)制DNA半不連續(xù)復(fù)制13①PCR技術(shù)的原理：在體外要靠溫度(90℃以上)打雙鏈，而不是解旋酶，也是以DNA為模板，需要引物，需DNA聚合酶，需要dNTP為前體。PCR與體內(nèi)(細(xì)胞內(nèi))DNA復(fù)制的最大差異是溫度。②檢測核分裂指數(shù)：在細(xì)胞培養(yǎng)中，加入3H標(biāo)記的dNTP前體物，被細(xì)胞攝取后，參與DNA復(fù)制，復(fù)制速度越快，參入的3H標(biāo)記的dNTP越多，可用液閃計數(shù)儀檢測放射性強度，據(jù)此判斷。DNA的復(fù)制給了我們一些啟示DNA的復(fù)制給了我們一些啟示14遺傳信息的傳遞是：

DNA→RNA→多肽(蛋白質(zhì))在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，RNA可形成cDNA，然后再由RNA→蛋白質(zhì)以上就是完整的中心法則理論，亦可稱為基因的表達(dá)(expression)。中心法則遺傳信息的傳遞是：中心法則15中心法則中心法則16反義鏈轉(zhuǎn)錄(transcription)反義鏈有意義鏈反義鏈轉(zhuǎn)錄(transcription)反義鏈有意義鏈17

轉(zhuǎn)錄(transcription)

以DNA為模板，合成RNA的過程。

非模板鏈稱為有意義鏈，而模板常稱為反義鏈。轉(zhuǎn)錄的過程大致是這樣的：以DNA一條鏈為模板，誘導(dǎo)RNA聚合酶活性、RNA聚合酶識別并結(jié)合在轉(zhuǎn)錄起始位點以ATP、GTP、CTP和UTP為前體，合成(轉(zhuǎn)錄)RNA

當(dāng)遇到轉(zhuǎn)錄終止信號時，轉(zhuǎn)錄即停止。轉(zhuǎn)錄(transcription)18由RNA→蛋白質(zhì)的過程，又叫翻譯。只有聚合酶II催化的反應(yīng)產(chǎn)物是mRNA，而只有mRNA才翻譯成蛋白質(zhì)?；?DNA)上三個相鄰的堿基組成一個密碼子，一個密碼子決定一種特定的氨基酸，共有43=64個密碼子。在轉(zhuǎn)錄過程中，基因上的三聯(lián)密碼子轉(zhuǎn)錄成mRNA上的三聯(lián)密碼子。mRNA由核內(nèi)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞漿中的核糖體上，以三聯(lián)密碼子指導(dǎo)合成蛋白質(zhì)。翻譯后的蛋白質(zhì)需要加工修飾。由RNA→蛋白質(zhì)的過程，又叫翻譯。只有聚合酶II催化的反應(yīng)19中心法則給了我們一些啟示：①遺傳信息由DNA上的基因決定。一旦基因發(fā)生突變，將最終導(dǎo)致所翻譯的蛋白質(zhì)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致生理功能改變，甚至出現(xiàn)疾病，如癌癥、肥胖等。②mRNA更能準(zhǔn)確簡便地反映DNA上基因所攜帶的遺傳信息。因此對基因序列的分析，常分析mRNA的序列即可。中心法則給了我們一些啟示：①遺傳信息由DNA上的基因決定。一20

③基因的表達(dá)有組織特異性，且受許多因素的影響，使mRNA的表達(dá)增強、降低甚至關(guān)閉，從而影響機體正常生理功能，甚至出現(xiàn)疾病。因此常需要檢測mRNA的表達(dá)的豐度(含量)，常用方法有Northernblot、RT-PCR。定量(Realtime)PCR等。這里需要特別強調(diào)：在檢測mRNA(或蛋白)表達(dá)時，一定要先弄清該基因在某種組織中是否有表達(dá)。③基因的表達(dá)有組織特異性，且受許多因素的影響，使mRNA的21

④根據(jù)中心法則，可以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下形成cDNA，于是建立了RT-PCR的方法。⑤根據(jù)mRNA的3’端有poly(A)的特點，在進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄時，就以poly(A)為模板設(shè)計了引物。并且純化mRNA的方法，也是根據(jù)poly(A)的原理設(shè)計的。⑥根據(jù)最后的翻譯蛋白質(zhì)去向的不同，建立不同的蛋白質(zhì)提取方法，如在線粒體，在細(xì)胞核、在細(xì)胞漿、分泌到血液中。④根據(jù)中心法則，可以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下形成cD22第二節(jié)常用分子生物學(xué)技術(shù)第二節(jié)常用分子生物學(xué)技術(shù)23MolecularCloningVectorsplasmidphagecDNAgenomiclibrariescDNAlibrariesDNAligationRecombinantDNAmoleculesTransformationSelectionchromosomewalkingmolecularhybridizationDNAsequencingThepolymerasechainreaction(PCR)inversePCRreversetranscriptasePCR

QuantitativePCRasymmetricPCRRNAiMultiplexPCRSouthernBlottingDNA?ngerprintingWesternblottingNorthernblottingArbitraryprimerPCRfluorescenceinsituhybridization(FISH)GenechiporDNAchip本章常用技術(shù)詞匯

MolecularCloningThepolymeras24一基因工程與分子克隆(geneticengineeringandmolecularcloning)一基因工程與分子克隆25Researchcontent:

genomiclibrary,cDNAlibrary,genecloning,geneexpression,generegulation,geneknockout一、用于基因克隆的工具酶

(enzymesforgenecloning)

在生物技術(shù)中常用的各種工具酶系指能用于DNA和RNA分子的切割、連接、聚合、反轉(zhuǎn)錄等有關(guān)的各種酶系統(tǒng)稱為工具酶。Researchcontent:26第六章-常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用課件27第六章-常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用課件28

由宿主控制的限制與修飾作用使得細(xì)菌避免噬菌體感染，如果噬菌體DNA沒有被修飾過，進(jìn)入宿主就會被限制性酶切斷。如果被修飾過，其侵染細(xì)菌的效率就提高。限制性內(nèi)切酶及由宿主控制的限制與修飾作用由宿主控制的限制與修飾作用使得細(xì)菌避免噬菌體感29二、分子克隆

(MolecularCloning)

二、分子克隆(MolecularCloning)

301.VectorsVectors:ADNA(aplasmidoraphageDNA)thatservesasacarrieringenecloningexperiments.

1.VectorsVectors:ADNA(apl31

質(zhì)粒載體必須具備的基本條件

(i)具有復(fù)制起點

(ii)具有可選擇的標(biāo)記

(iii)具有若干限制酶單一識別位點

(iv)具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)

(v)作為表達(dá)載體還有啟動子，轉(zhuǎn)錄、翻譯信號，終止子序列等片段。質(zhì)粒載體必須具備的基本條件(i)具有復(fù)制起點32lacZThestructionofplasmidlacZThestructionofplasmid33

screen

cloning

screen

cloning34第六章-常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用課件35?λ噬菌體載體：Charon系列，分為取代型和插入型：取代型可接受20kb左右的外源DNA，適合于構(gòu)建基因組文庫。插入型只可接受10kb以內(nèi)的外源DNA，適合于構(gòu)建cDNA文庫。?λ噬菌體載體：Charon系列，分為取代型和插入型：36第六章-常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用課件37第六章-常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用課件38（1）人工合成（一般限于數(shù)十個核苷酸的片段）

其原理是在測定肽鏈或蛋白順序的基礎(chǔ)上，根據(jù)遺傳密碼推測mRNA序列和DNA序列，經(jīng)嚴(yán)格設(shè)計、以化學(xué)法合成DNA。生長激素釋放抑制因子、胰島素、干擾素表皮生長因子等基因都曾以這樣的方法合成，這種合成還可分段進(jìn)行，繼后再連接。但這類方法很難考慮遺傳密碼簡并以及內(nèi)含子的存在等問題。2、目標(biāo)基因的獲得（1）人工合成（一般限于數(shù)十個核苷酸的片段）

其39(2)逆轉(zhuǎn)錄法合成cDNA第一、二條鏈(2)逆轉(zhuǎn)錄法合成cDNA第一、二條鏈40三、基因組DNA文庫目錄三、基因組DNA文庫目錄41四、染色體步移四、染色體步移42

是以不同個體或不同細(xì)胞來源的基因組片段（包括mRNA-cDNA、cDNA-cDNA、DNA-DNA）之間，在一定條件下變性、復(fù)性。一旦某一個體細(xì)胞缺失了某一DNA片段或某mRNA不正常表達(dá)，在與正常來源的DNA片段或正常表達(dá)mRNA的cDNA進(jìn)行DNA-DNA，cDNA-mRNA或cDNA-DNA雜交時，未缺失的特定DNA片段或正常表達(dá)的mRNA逆轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA片段就會因沒有與其同源的互補順序而不形成雜交體，從而出現(xiàn)部分單鏈。通過某種方法，將形成雜交雙鏈的片段排除（消減），未形成完整雜交體的DNA或cDNA片段分離出來，即可得到相應(yīng)的片段或探針。五、消減雜交是以不同個體或不同細(xì)胞來源的基因組片段（包括mRNA43第六章-常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用課件44一個標(biāo)準(zhǔn)的克隆外源片段過程一個標(biāo)準(zhǔn)的克隆外源片段過程45植物轉(zhuǎn)基因——抗蟲棉植物轉(zhuǎn)基因——抗蟲棉46動物轉(zhuǎn)基因—生物反應(yīng)器動物轉(zhuǎn)基因—生物反應(yīng)器47二分子雜交與印跡技術(shù)

Molecularhybridization

&blottingtechnology二分子雜交與印跡技術(shù)

Molecularhybridiz48核酸分子雜交

(nucleicacidhybridization)在DNA復(fù)性過程中，把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可在不同的分子之間形成雜化雙鏈的這種現(xiàn)象。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理雜交的原理實質(zhì)是核酸分子的變性與復(fù)性過程核酸分子雜交(nucleicacidhybridiza49復(fù)性RNADNA復(fù)性RNADNA50（一）印跡技術(shù)1.具體步驟SouthernE1975年首次應(yīng)用

SouthernEM.DetectionofspecificsequencesamongDNAfragmentsseparatedbygelelectrophoresis.

JMolBiol，1975,98(3):503-517.原始文獻(xiàn)出處：（一）印跡技術(shù)1.具體步驟SouthernE51（一）印跡技術(shù)1.具體步驟

SouthernE1975年首次應(yīng)用

瓊脂糖分離的DNA片段→變性為單鏈→將一張NC膜放在膠上，上面放吸水紙巾→利用毛細(xì)作用使膠中的DNA片段轉(zhuǎn)移到NC膜上，使之成為固相化分子。

載有DNA單鏈分子的NC膜可在雜交液與另一種DNA或RNA分子（探針）雜交，具有互補序列的RNA或DNA結(jié)合到存在于NC膜的DNA分子上，經(jīng)檢測分析可顯現(xiàn)出雜交分子的區(qū)帶。（一）印跡技術(shù)1.具體步驟SouthernE522.印跡(blotting)定義將存在于凝膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移（印跡）或直接放在固相化介質(zhì)上并加以檢測分析的技術(shù)。3.應(yīng)用

廣泛用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)的檢測4.發(fā)展

電轉(zhuǎn)移印跡技術(shù)、真空吸引轉(zhuǎn)移印跡等2.印跡(blotting)定義將存在于凝膠中的生物大53（二）探針技術(shù)探針(probe)的概念

用來檢測某一特定核苷酸序列或基因序列的DNA片段或RNA片段探針的種類寡核苷酸探針基因組DNA探針cDNA探針RNA探針（二）探針技術(shù)探針(probe)的概念用來檢測54

將探針與固定在NC膜上的DNA或RNA進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，探針的序列如與NC膜上的核酸序列相互補，就可結(jié)合到膜上的相應(yīng)區(qū)帶，經(jīng)放射自顯影或其他檢測手段就可判斷膜上是否有同源的核酸分子存在。探針技術(shù)的概念將探針與固定在NC膜上的DNA或RNA進(jìn)行55二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）DNA印跡技術(shù)

(Southernblotting)

（二）RNA印跡技術(shù)

(Northernblotting)

（三）蛋白質(zhì)的印跡分析

(Westernblotting)

二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）DNA印跡技術(shù)(Southe56（一）SouthernblottingM1210×SSC

轉(zhuǎn)移緩沖液Whatman濾紙凝膠Whatman濾紙紙巾玻璃板重物支持物500g12與探針同源雜交的基因DNA片段基因組DNADNA酶切片段內(nèi)切酶NC或尼龍膜NC膜或尼龍膜（一）SouthernblottingM1210×SSC57

基因組DNA的定性與定量分析。如對在基因組中特異基因的定位及檢測等。重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。Southertblotting用途基因組DNA的定性與定量分析。Southertblott58放射自顯影照片放射自顯影照片59（二）RNA印跡技術(shù)(Northernblotting)相同點：AlwineJC,etal.MethodfordetectionofspecificRNAsinagarosegelsbytransfertodiazobenzyloxymethyl-paperandhybridizationwithDNAprobes.ProcNatlAcadSciUSA,

1977,74(12):5350-5354原始文獻(xiàn)出處名稱相對于Southernblotting轉(zhuǎn)移的是RNA轉(zhuǎn)移前無需酶切轉(zhuǎn)移效率較高變性方法不同點原理均為毛細(xì)作用。（二）RNA印跡技術(shù)(Northernblotting)相60（二）RNA印跡技術(shù)Northernblotting用途檢測某一組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA

的表達(dá)水平。比較不同組織和細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。（二）RNA印跡技術(shù)Northernblotting用途61Northernblotting結(jié)果Northernblotting結(jié)果62由于基因組測序的完成及基因芯片技術(shù)的成熟以上兩種技術(shù)應(yīng)用的越來越少由于基因組測序的完成及基因芯片技術(shù)的成熟以上兩種技術(shù)應(yīng)用的越63（三）蛋白質(zhì)的印跡技術(shù)(免疫印跡)

首先將混合蛋白質(zhì)用PAGE按分子大小分開，再將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜上，蛋白質(zhì)的位置可保持在膠中的原位上。與DNA和RNA印跡相似之處（三）蛋白質(zhì)的印跡技術(shù)(免疫印跡)首先將混合64蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移只有靠電轉(zhuǎn)移。蛋白質(zhì)的檢測以抗體作探針。用堿性磷酸酶（ALP）、辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記第二抗體，底物顯色來檢測蛋白區(qū)帶的信號，底物亦可與化學(xué)發(fā)光劑結(jié)合以提高敏感度?；蛴猛凰貥?biāo)記第二抗體，放射自顯影法檢測蛋白區(qū)帶的信號。與DNA和RNA印跡不同之處蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移只有靠電轉(zhuǎn)移。與DNA和RNA印跡不同之處65Westernblotting應(yīng)用

檢測樣品中的特異蛋白質(zhì)的存在。細(xì)胞中特異蛋白質(zhì)的定量分析。蛋白質(zhì)分子的相互作用研究。Westernblotting應(yīng)用檢測樣品中的特異蛋白質(zhì)66Westernblotting應(yīng)用SDSpurifiedrecombinanthumanCK2αsubunitanditsWesternblotting用已知的特異抗體檢測目的基因蛋白Westernblotting應(yīng)用SDSpur67三種印跡技術(shù)的比較Westernblotting垂直槽Northernblotting水平槽Southernblotting水平槽三種印跡技術(shù)的比較Westernblotting垂直槽No68

斑點或狹線印跡(dotorslotblotting)

原位雜交

(insituhybridization)DNA芯片技術(shù)(DNAchip)

其他印跡技術(shù)斑點或狹線印跡(dotorslotblotting69三PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用

（PolymeraseChainReaction，PCR）聚合酶鏈反應(yīng)三PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用

（PolymeraseCha70

PCR技術(shù)是1985年由美國科學(xué)家KaryBMullis建立的體外擴(kuò)增基因片段的方法，它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點，是分子生物學(xué)技術(shù)中一項具有革命性的創(chuàng)舉。PCR方法被美國Science雜志評為1989年的十大科技成就之一，而TaqDNA聚合酶被評選為象征1989年的“年分子”(themoleculeofyear)。PCR技術(shù)是1985年由美國科學(xué)家KaryB71TheNobelPrizeinChemistry1993"forcontributionstothedevelopmentsofmethodswithinDNA-basedchemistry"MichaelSmith1944-1932-2000LaJolla,CA,USAKaryB.MullisUniversityofBritishColumbiaVancouver,Canada"forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method""forhisfundamentalcontributionstotheestablishmentofoligonucleotide-based,site-directedmutagenesisanditsdevelopmentforproteinstudies"TheNobelPrizeinChemistry1725Primer15Primer2Cycle2Cycle15555

5

5TemplateDNA一、PCR技術(shù)的工作原理555555555Primer15Primer2Cycle2Cyc73Cycle355

5555555

5

55555

525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。Cycle3555555555574模板DNA

特異性引物耐熱DNA聚合酶

dNTPsMg2+

PCR體系基本組成成分模板DNAPCR體系基本組成成分75PCR反應(yīng)循環(huán)變性95?C左右延伸適溫退火Tm-5?C

經(jīng)過30個左右的循環(huán)后，PCR的擴(kuò)增倍數(shù)為(1+x)n,x=75%,n為循環(huán)數(shù).PCR反應(yīng)循環(huán)變性延伸退火經(jīng)過30個左右的循環(huán)后，P762.利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已知目的基因片段。3.利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得具有一定同源性的基因片段。4.利用隨機引物從cDNA文庫或基因組文庫中隨機克隆基因。1.與反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接從組織和細(xì)胞的mRNA獲得目的基因片段。二、PCR技術(shù)的主要用途（一）目的基因的克隆2.利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已知目77（二）基因的體外突變（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列測定（五）基因突變分析二、PCR技術(shù)的主要用途（二）基因的體外突變二、PCR技術(shù)的主要用途78三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)（一）反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)(RT-PCR)（二）實時PCR技術(shù)(realtimePCR)（三）反向PCR（inversePCR）（四）不對稱PCR（asymmetricPCR）（五）復(fù)合PCR（MultiplexPCR）（六）隨機引物PCR(arbitraryprimerPCR)三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)（一）反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)(RT-79RT-PCR技術(shù)AAnATTnT5′5′mRNA反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA3′TTnTAAnA核糖核酸酶HTTnT3′DNApolyIcDNA核酸酶S1雙鏈cDNA3′5′3′5′5′加熱變性加入特異性引物DNA聚合酶PCR擴(kuò)增出大量的產(chǎn)物RT-PCR技術(shù)AAnATTnT5′5′mRNA反轉(zhuǎn)錄酶80實時PCR技術(shù)原理實時PCR技術(shù)原理81

反向PCR的目的在于擴(kuò)增一段已知序列旁側(cè)的DNA，也就是說這一反應(yīng)體系不是在一對引物之間而是在引物外側(cè)合成DNA。反向PCR可用于研究與已知DNA區(qū)段相連接的未知染色體序列。這時選擇的引物雖然與核心DNA區(qū)兩末端序列互補，但兩引物3’端是相互反向的。擴(kuò)增前先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品DNA，然后用DNA連接酶連接成一個環(huán)狀DNA分子，通過反向PCR擴(kuò)增引物的上游片段和下游片段。反向PCR（inversePCR）反向PCR的目的在于擴(kuò)增一段已知序列旁側(cè)的DNA，也82

是一種二條DNA模板不等擴(kuò)增的PCR，通過調(diào)整一對引物濃度（如100：1），使擴(kuò)增出的產(chǎn)物大部分為濃度高引物合成的單鏈DNA。有利于測序或制備探針。

不對稱PCR（asymmetricPCR）：是一種二條DNA模板不等擴(kuò)增的PCR，通過調(diào)整一對引83

用多對引物同時擴(kuò)增幾條DNA片段的方法稱為復(fù)合PCR。

復(fù)合PCR（MultiplexPCR）：用多對引物同時擴(kuò)增幾條DNA片段的方法稱為復(fù)合PCR84

RAPD（RandomAmplificationofPolymorphicDNA）隨機引物擴(kuò)增多態(tài)DNA，或隨機引物擴(kuò)增PCR（arbitraryprimerPCR,AP-PCR）。

常規(guī)PCR通常擴(kuò)增一個已知DNA片段，所設(shè)計的引物也是根據(jù)相應(yīng)序列的側(cè)翼順序。擴(kuò)增產(chǎn)物為一個特異片段。

RAPD包含多個PCR反應(yīng)和多個引物，引物是隨意設(shè)計的10bp片段，其擴(kuò)增的是一組未知的片段，在事先不知道DNA序列的情況下，產(chǎn)生DNA指紋模式，可進(jìn)行親緣關(guān)系分析、系統(tǒng)發(fā)育分子水平的鑒定。如果在二個基因組的RAPD反應(yīng)用同一組引物，則可以比較基因組間的差異。利用這種差異有可能追蹤性狀的差異。RAPD（RandomAmplificati85四核酸序列分析

Nucleicacidsequenceanalysis四核酸序列分析

Nucleicacidse86核酸序列分析的基本原理化學(xué)裂解法(Maxam-Gillbert法)略DNA鏈的末端合成終止法(Sanger法)核酸序列分析的基本原理化學(xué)裂解法(Maxam-Gillbe87(Sanger雙脫氧鏈終止法)HOPOPOPOCH2OOOOHOHOHOA,C,GorT1′3′OHαβγ5′雙脫氧核苷三磷酸脫去二、DNA鏈末端合成終止法Sanger1958年和1980年兩次獲Nobel獎(Sanger雙脫氧鏈終止法)HOPO88第六章-常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用課件89第六章-常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用課件90TheNobelPrizeinChemistry1980"forhisfundamentalstudiesofthebiochemistryofnucleicacids,withparticularregardtorecombinant-DNA""fortheircontributionsconcerningthedeterminationofbasesequencesinnucleicacids"PaulBergWalterGilbertFrederickSanger1/2oftheprize1/4oftheprize1/4oftheprizeStanfordUniversityStanford,CA,USAHarvardUniversity,BiologicalLaboratoriesCambridge,MA,USAMRCLaboratoryofMolecularBiologyCambridge,UnitedKingdom

1926-1932-1918-TheNobelPrizeinChemistry191三、DNA自動測序用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實現(xiàn)DNA序列分析自動化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標(biāo)記4種ddNTP，然后進(jìn)行Sanger測序反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細(xì)管電泳）分離。通過4種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出4種不同波長熒光，檢測器采集熒光信號，并依此確定DNA堿基的排列順序。

三、DNA自動測序用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實現(xiàn)DNA序列分92ABIPRISM310型DNA測序儀主要用于DNA序列分析

(包括DNA測序,衛(wèi)星序列、雜合子序列和三聯(lián)體序列分析，單鏈構(gòu)象多態(tài)分析,長片段PCR分析)，遺傳疾病診斷，親子鑒定等ABIPRISM310型DNA測序儀主要用于DNA序列93PE3700型DNA測序儀PE3700型DNA測序儀94DNA自動測序結(jié)果舉例DNA自動測序結(jié)果舉例95五、生物大分子相互作用研究技術(shù)

TheMethodofProtein-proteinandProtein-DNAInteractionStudy五、生物大分子相互作用研究技術(shù)96一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)酵母雙雜交各種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等）熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析噬菌體顯示系統(tǒng)篩選常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)酵母雙雜交常用蛋白質(zhì)相互作用的研究97標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實驗是一個基于親和色譜原理的、分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用的方法。（一）標(biāo)簽蛋白沉淀標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實驗主要用于證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結(jié)合、分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位及篩選