進(jìn)出口食品中耐熱大腸菌群快速計(jì)數(shù)法

《出口貝類中大腸菌群、糞大腸菌群檢測(cè)方法》編制說明1.任務(wù)來源根據(jù)國家出入境檢驗(yàn)檢疫總局2011年下達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)編寫任務(wù)通知（計(jì)劃編號(hào)：2011B145），由福建出入境檢驗(yàn)檢疫局主持中華人民共和國國家出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《出口貝類中大腸菌群、糞大腸菌群檢測(cè)方法》的編制起草工作。2.目的和意義貝類，多指軟體動(dòng)物門中的瓣鰓綱（或雙殼綱）動(dòng)物，一般體外披有1~2塊貝殼，常見的有牡蠣、貽貝、蛤、蟶等。由于貝類生長(zhǎng)位置較穩(wěn)定，一旦遇到污染，很難回避；且貝類多屬于濾食型生物，在進(jìn)食食物的同時(shí)，也將水中的有毒有害物質(zhì)吸入體內(nèi)。隨著近海沿岸水域人類活動(dòng)的日益頻繁，近幾年貝類受到到大腸菌群、糞大腸菌群污染的事件時(shí)有報(bào)道。大腸菌群、糞大腸菌群作為常用的指標(biāo)菌，被廣泛應(yīng)用于各類水產(chǎn)品的檢驗(yàn)。目前，系統(tǒng)內(nèi)尚無專門針對(duì)貝類中大腸菌群、糞大腸菌群檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法。因此本制標(biāo)項(xiàng)目將在現(xiàn)有的相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)和檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，參考國外相關(guān)檢測(cè)方法，研究制定貝類（及其產(chǎn)品）適用的大腸菌群、糞大腸菌群檢測(cè)方法，以適應(yīng)日益增長(zhǎng)的技術(shù)執(zhí)法中對(duì)貝類中大腸菌群、糞大腸菌群檢測(cè)的需要?！柏愵愔写竽c菌群、糞大腸菌群檢測(cè)方法”目前無相同的國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，我國現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)“食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)水產(chǎn)食品檢驗(yàn)”（GB/T4789.20-2003）未規(guī)定糞大腸菌群檢測(cè)方法，“鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)”（GB2733-2005）、“出口活貝類檢驗(yàn)規(guī)程”（SN/T0375-1995）等相關(guān)國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)也未就貝類中大腸菌群、糞大腸菌群檢測(cè)方法進(jìn)行規(guī)定。本制標(biāo)項(xiàng)目將現(xiàn)有的相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)和檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，參考國外相關(guān)檢測(cè)方法，結(jié)合多年來國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)際應(yīng)用情況，吸收新的檢測(cè)技術(shù)或手段，研究制定新的貝類中大腸菌群、糞大腸菌群檢測(cè)方法，并進(jìn)行驗(yàn)證和編制。3制標(biāo)依據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/1.1-2000《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則》的要求進(jìn)行編寫。其中技術(shù)路線參照美國食品藥品管理局（FDA）《細(xì)菌分析手冊(cè)》第4章大腸桿菌和大腸菌群計(jì)數(shù)（2002年）（BacteriologicalAnalyticalManual，Chapter4:EnumerationofEscherichiacoliandthecoliformbacteria,2002）進(jìn)行修改。引用了如下標(biāo)準(zhǔn)的部分內(nèi)容：GB/T4789.20食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)水產(chǎn)食品檢驗(yàn)GB17378.7海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范第3部分：樣品采集、貯存與運(yùn)輸SN/T1538.1培養(yǎng)基制備指南第1部分：實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證通則SN/T1538.2培養(yǎng)基制備指南第2部分：培養(yǎng)基性能測(cè)試實(shí)用指南參考比較了GB4789.3《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》、GB4789.39《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)糞大腸菌群計(jì)數(shù)》以及GB17378.27《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范第7部分：近海污染生態(tài)調(diào)查和生物監(jiān)測(cè)》等方法，制訂適用貝類的大腸菌群、糞大腸菌群檢測(cè)方法。4研究過程在建立了本方法（以下稱其為“貝類大腸菌群、糞大腸菌群檢測(cè)法”）后，對(duì)其進(jìn)行了方法驗(yàn)證。方法驗(yàn)證包括兩部分：室內(nèi)方法比較研究和室間協(xié)作試驗(yàn)。4.1室內(nèi)方法比較研究以檢測(cè)人工污染相同濃度添加菌樣品的方式，比較了貝類大腸菌群、糞大腸菌群檢測(cè)方法采取200g取樣量及5管接種培養(yǎng)法，與通常食品中25g取樣量及3管接種法的差異；同時(shí)，還研究了貝類大腸菌群、糞大腸菌群相對(duì)準(zhǔn)確性和特異性。大腸菌群、糞大腸菌群作為衛(wèi)生指示菌達(dá)到一定數(shù)量才表明貝類衛(wèi)生狀況差，貝類中檢測(cè)出的大腸菌群、糞大腸菌群數(shù)如果很低并沒有多少實(shí)際意義，因此未進(jìn)行該方法的檢出限研究。4.2室間協(xié)作試驗(yàn)組織了6個(gè)實(shí)驗(yàn)室，其中包括一家生產(chǎn)出口貝類產(chǎn)品的企業(yè)實(shí)驗(yàn)室，采用1種貝類樣品，3個(gè)污染水平的實(shí)驗(yàn)室間協(xié)作實(shí)驗(yàn)，確定了本方法的重復(fù)性值和再現(xiàn)性值。5研究?jī)?nèi)容5.1室內(nèi)方法比較研究5.1.1取樣量及接種培養(yǎng)法的比較本方法對(duì)貝類樣品的取樣量為200g，采用5管法接種培養(yǎng)，不同于通常食品25g的取樣量，采用3管接種培養(yǎng)。采用相同濃度的人工污染貝類樣品，按兩種不同取樣量、不同的接種管數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，比較檢測(cè)大腸菌群、糞大腸菌群結(jié)果的差異。方法5.1.1.1.1基質(zhì)：經(jīng)過熱處理的花蛤、貽貝樣品，剝?nèi)ルp殼取蛤肉及殼瓣內(nèi)液體均質(zhì)（不加稀釋液），經(jīng)菌落總數(shù)測(cè)定為不含菌的陰性樣品。5.1.1.1.2菌株：大腸埃希氏菌ATCC25922購自上海漢尼公司。將冷凍保存的大腸埃希氏菌菌株置室溫回溫后，接種于營養(yǎng)肉湯中制成菌懸液，至36.5°C培養(yǎng)18?24h，取1mL菌液肉湯加入9mL稀釋液制成1/10的菌液稀釋液后，按1/10做成系列稀釋度，選擇合適系列稀釋度的菌懸液備用。5.1.1.1.3接種水平：用上述菌懸液的合適濃度的稀釋液分別接種2種貝類基質(zhì)，每種貝類按101?102CFU/mL、102?103CFU/mL、104?105CFU/mL分別接種3個(gè)樣品，每個(gè)樣品為225g，經(jīng)過均質(zhì)混勻后，分成200g、25g待檢。5.1.1.1.4分析：按貝類大腸菌群、糞大腸菌群檢測(cè)方法，取樣量為200g，采用5管法；另外，按通常的取樣量為25g，采用3管法。比較兩種不同取樣量、不同的接種管數(shù)檢測(cè)結(jié)果的差異。檢測(cè)結(jié)果見下表。表1比較兩種不同取樣量及不同接種管數(shù)培養(yǎng)法的檢測(cè)結(jié)果污染水平取樣量、接種法花蛤貽貝檢測(cè)結(jié)果（MPN/g）檢測(cè)結(jié)果（MPN/g）低200g，5管法1308025g，3管法12075中200g，5管法940180025g，3管法4302100200g，5管法54003400

高25g，3管法43001500t值t=1.784<(t005=%571)P值P>0.05'從對(duì)兩種人工污染樣品三個(gè)接種水平兩種取樣量計(jì)數(shù)結(jié)果可以看出，兩種方法所得結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，無顯著差異，從檢測(cè)結(jié)果來看，取樣量為200g的檢測(cè)數(shù)值大部分大于取樣量為25g的檢測(cè)數(shù)值，說明取樣量大檢出的菌量會(huì)相對(duì)多點(diǎn)，也可能與試驗(yàn)樣本數(shù)不夠多有關(guān)系。5.1.2相對(duì)準(zhǔn)確性方法2.1實(shí)驗(yàn)菌株菌液制備采用5.1.1.1制備的基質(zhì)，分別稱取四份各200g花蛤肉均質(zhì)待用。添加菌液制備同5.1.1.2，將過夜培養(yǎng)的菌懸液，10倍遞增稀釋至所需濃度（本實(shí)驗(yàn)采用10-6、10-7、10-8、10-9四種稀釋度），每個(gè)稀釋度取1mL分別添加到四份200g花蛤肉中均質(zhì)混勻，分成四組，按照貝類大腸菌群、糞大腸菌群檢測(cè)法檢測(cè)，同時(shí)用常用的3管法計(jì)數(shù)所添加菌液含菌量。結(jié)果表2大腸菌群數(shù)量的檢測(cè)結(jié)果組別貝類大腸菌群檢測(cè)方法所添加菌液含菌量陽性反應(yīng)管數(shù)MPN（每克）陽性反應(yīng)管數(shù)MPN（每克/毫升）95%可信限1g0.1g0.01g1g0.1g0.01g下限上限155416033211018410554160553925539255254254222322214435422254117543285321434313.321120.454.24323.44101.73412.44403.44000<0.2000<0.3—0.95000<0.2

000<0.2000<0.2000<0.2由于只添加大腸埃希氏菌1種菌，糞大腸菌群的檢測(cè)結(jié)果與大腸菌群的檢測(cè)結(jié)果基本一致，不再單獨(dú)列表說明。以上試驗(yàn)選用凍煮花蛤作為人工污染樣品基質(zhì)，用傳統(tǒng)3管法對(duì)添加到蛤肉中的菌液含大腸埃希氏菌的量進(jìn)行計(jì)數(shù)，同時(shí)，采用貝類大腸菌群、糞大腸菌群檢測(cè)法檢測(cè)人工污染貝類中的菌量。從以上幾種濃度菌液的計(jì)數(shù)結(jié)果可以看出，用該方法所得計(jì)數(shù)結(jié)果，基本落在所添加菌液含菌量的95%可信限范圍內(nèi)，因此，采用該方法能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出貝類中所含的大腸菌群、糞大腸菌群的數(shù)量。5.1.3特異性方法選取15株大腸菌群菌株和25株非大腸菌群菌株，將40株菌分別接種到經(jīng)過熱處理為不含菌的40份花蛤樣品中，接種水平約為102cfu/mL，采用貝類大腸菌群檢測(cè)法，按取樣量與稀釋液之比為1：2的比例混勻，各取2mL加入10mL雙料LST管中，共接5管，只要5管中有一管產(chǎn)酸產(chǎn)氣并經(jīng)過BGLB證實(shí)，說明所添加的菌能夠被檢出判定為陽性，反之為未檢出判定為陰性。結(jié)果貝類大腸菌群檢測(cè)法的特異性見表3。表3貝類大腸菌群檢測(cè)法特異性研究菌株中文名菌株學(xué)名菌株號(hào)菌株來源結(jié)果大腸埃希氏菌EscherichiacoliATCC25922購自上海漢尼公司陽性大腸埃希氏菌EscherichiacoliATCC8739?？箯S提供陽性大腸埃希氏菌Escherichiacoli44110購自中國藥品生物制品檢定所陽性大腸埃希氏菌Escherichiacoli44155購自中國藥品生物制品檢定所陽性大腸埃希氏菌Escherichiacoli44106購自中國藥品生物制品檢定所陽性大腸埃希氏菌Escherichiacoli44103購自中國藥品生物制品檢定所陽性大腸埃希氏菌EscherichiacoliATCC10536購自陸橋公司陽性大腸埃希氏菌EscherichiacoliCC008本室分離菌株陽性阪崎腸桿菌EnterobactersakazakiiATCC29544購自陸橋公司陽性阪崎腸桿菌EnterobactersakazakiiATCC51329購自上海漢尼公司陽性阪崎腸桿菌EnterobactersakazakiiATCC50205上海局提供陽性肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae46117購自中國藥品生物制品檢定所陽性

肺炎克雷伯氏菌KlebsiellapneumoniaeATCC4352購自上海漢尼公司陽性產(chǎn)酸克雷伯氏菌KlebsiellaoxytocaATCC700324生物梅里埃公司提供陽性陰溝腸桿菌EnterobactercloacaeCC031本室分離菌株陽性弗氏檸檬酸桿菌CitrobacterfreundiiATCC8090購自上海漢尼公司陰性弗氏檸檬酸桿菌CitrobacterfreundiiCC029本室分離菌株陰性布氏檸檬酸桿菌CitrobacterbraakiiCC012本室分離菌株陰性普通變形菌ProteusvulgarisATCC49132購自上海漢尼公司陰性奇異變形菌ProteusmirabilisATCC43072購自上海漢尼公司陰性奇異變形菌ProteusmirabilisCC010本室分離菌株陰性遲鈍愛德華氏菌EdwardsiellatardaATCC15947購自上海漢尼公司陰性甲型副傷寒沙門氏菌SalmonellaparatyphiACC002福建CDC提供陰性豬霍亂沙門氏菌SalmonellacholeraesuisATCC13311?？箯S提供陰性鼠傷寒沙門氏SalmonellatyphimuriumATCC14028購自上海漢尼公司陰性腸炎沙門氏菌SalmonellaenteritidisATCC13076購自上海漢尼公司陰性腸炎沙門氏菌Salmonellaenteritidis5041購自中國藥品生物制品檢定所陰性浦那沙門氏菌SalmonellapoonaNCTC-4840購自上海漢尼公司陰性宋內(nèi)氏志賀氏菌ShigellasonneiATCC25931購自上海漢尼公司陰性痢疾志賀氏菌Shigelladysenteriae51252購自中國藥品生物制品檢定所陰性蠟樣芽孢桿菌BacilluscereusATCC11778購自上海漢尼公司陰性副溶血性弧菌VibrioparahaemolyticusATCC17802購自上海漢尼公司陰性副溶血性弧菌Vibrioparahaemolyticus1.1997購自中科院微生物所菌種中心陰性溶血性鏈球菌Streptococcushemolytics33210-4a購自中國藥品生物制品檢定所陰性銅綠假單胞菌PseudomonasaeruginosaATCC27853購自上海漢尼公司陰性金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC6538福抗廠提供陰性表皮葡萄球菌StaphylococcusepidermidisATCC12228?？箯S提供陰性單增李斯特氏菌ListeriamonocytogenesATCC7644購自上海漢尼公司陰性英諾克李斯特ListeriainnocuaATCC33090購自上海漢尼公司陰性氏菌購自中科院微生物所 陰性糞腸球菌Enterococcusfaecalis1.013購自中科院微生物所 陰性菌種中心從上表可以看出，采用貝類大腸菌群、糞大腸菌群檢測(cè)法，對(duì)貝類中添加的15株大腸菌群菌株均能夠檢出，對(duì)貝類中添加的25株非大腸菌群菌株均未檢出，說明本方法特異性為100%。5.2室間協(xié)作試驗(yàn)5.2.1室間協(xié)作試驗(yàn)通知進(jìn)行協(xié)作試驗(yàn)之前向各實(shí)驗(yàn)室發(fā)送“《出口貝類中大腸菌群、糞大腸菌群檢測(cè)方法》室間協(xié)作實(shí)驗(yàn)的通知”，說明協(xié)作試驗(yàn)?zāi)康?、?nèi)容、時(shí)間安排等信息。5.2.2測(cè)試樣品5.2.2.1樣品基質(zhì)本次試驗(yàn)樣品基質(zhì)選用經(jīng)過熱處理的文蛤，將文蛤去殼，取蛤肉及殼瓣內(nèi)液體均質(zhì)(不加稀釋液)，并用平板計(jì)數(shù)法檢查文蛤中大腸菌群、糞大腸菌群數(shù)，確定該樣品里不含有的大腸菌群、糞大腸菌群數(shù)。將均質(zhì)好的文蛤樣品分裝到無菌樣品瓶中，每瓶分裝200g均質(zhì)樣品。菌株大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)ATCC25922和弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)ATCC8090購自上海漢尼公司，大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)44110購自中國藥品生物制品檢定所。將這3株菌分別接種在平板計(jì)數(shù)瓊脂平板上，37°C過夜培養(yǎng)。從平板上取菌混和于磷酸鹽緩沖液(Butterfield’sbufferedphosphatediluent)中，制備成混合菌懸液，然后用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行10倍系列稀釋。5.2.2.3人工污染樣品貝類樣品制成高、中、低三個(gè)污染水平的樣品。將裝有已均質(zhì)好的蛤肉的樣品瓶分成3組，選取3個(gè)不同濃度的菌懸液等量添加到三個(gè)樣品基質(zhì)中，每瓶添加的菌液為1mL，混勻。制備好的樣品的污染水平大致為：高污染濃度約為104MPN/g(mL)?105MPN/g(mL)，中污染濃度約為102MPN/g(mL)?103MPN/g(mL)，低污染濃度約為10】MPN/g(mL)?102MPN/g(mL)。樣品制備好，編號(hào)后立即放于冰箱冷凍保存。5.2.3參加實(shí)驗(yàn)室邀請(qǐng)了檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)、福建CDC、水產(chǎn)品加工企業(yè)的微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室共6個(gè)作為參加實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室編號(hào)為1?6。5.2.4樣品分發(fā)每個(gè)實(shí)驗(yàn)室接收到3份樣品，樣品標(biāo)記為樣品1、樣品2、樣品3。發(fā)送樣品時(shí)，從冰箱中取出樣品用泡沫保溫盒(內(nèi)有冰袋)包裝，一早用快遞寄往參加實(shí)驗(yàn)室，隨樣品寄送“室間協(xié)作試驗(yàn)作業(yè)指導(dǎo)書”。樣品抵達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，立即放于冰箱冷凍保存，直至約定的檢測(cè)日期。5.2.5樣品檢測(cè)6個(gè)實(shí)驗(yàn)室按照“室間協(xié)作試驗(yàn)作業(yè)指導(dǎo)書”的要求在約定日期同時(shí)開始檢測(cè)樣品。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用貝類大腸菌群、糞大腸菌群檢測(cè)法檢測(cè)3份樣品中的大腸菌群、糞大腸菌群。5.2.6協(xié)作試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析檢測(cè)結(jié)果記錄在統(tǒng)一的記錄表上，交給本次協(xié)作試驗(yàn)組織者。全部檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成以10為底的對(duì)數(shù)再用于統(tǒng)計(jì)分析。5.2.7結(jié)果和討論6個(gè)實(shí)驗(yàn)室參加了此次協(xié)作試驗(yàn)，按照規(guī)定的時(shí)間，檢測(cè)了3份樣品。檢測(cè)結(jié)果見表4,統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表5。 表4貝類樣品中大腸菌群、糞大腸菌群協(xié)作試驗(yàn)結(jié)果 樣品1（低污染） 樣品2（中污染）實(shí)驗(yàn) 大腸菌群 糞大腸菌群 大腸菌群 糞大腸菌群 大，室編結(jié)果值對(duì)數(shù)值結(jié)果值對(duì)數(shù)值結(jié)果值對(duì)數(shù)值結(jié)果值對(duì)數(shù)值結(jié)果值號(hào)（MPN/g） （MPN/g） （MPN/g） （MPN/g） （MPN/g1391.59221.349402.974602.66280002261.41211.324902.692302.36240003341.53221.346302.803302.52350004241.38211.3212003.087002.85920005321.51261.417902.904802.6