腸桿菌科細(xì)菌金屬-內(nèi)酰胺酶的基因型及流行情況

腸桿菌科細(xì)菌金屬-內(nèi)酰胺酶的基因型及流行情況

隨著碳綠霉素在臨床上的廣泛應(yīng)用，抗碳綠霉素的腸球菌（cre）逐漸增加。產(chǎn)碳青霉烯酶是腸桿菌科細(xì)菌耐碳青霉烯類抗生素的重要機(jī)制。碳青霉烯酶是指能夠明顯水解亞胺培南或美羅培南等碳青霉烯類抗生素的一類β-內(nèi)酰胺酶,包括Ambler分子結(jié)構(gòu)分類的A、B、D三類酶,其中A、D類為絲氨酸酶,屬于Bush分群中的第2f和2d亞組;金屬β-內(nèi)酰胺酶屬于AmblerB類(Bush3組),其催化活性依賴Zn1材料和方法1.1材料表面1.1.1菌株的篩選和生化鑒定3297株腸桿菌科細(xì)菌均分離自重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2007年1月—2011年12月住院確診感染患者的送檢標(biāo)本(痰液、血液、尿液、分泌物、膽汁等),剔除同一患者分離的重復(fù)菌株;包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、陰溝腸桿菌、奇異變形桿菌、黏質(zhì)沙雷菌等。常規(guī)分離菌株,采用VITEK2Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行生化鑒定并保存。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603,均為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。對(duì)疊氮鈉耐藥的大腸埃希菌J53Az1.1.2試劑與質(zhì)粒提取亞胺培南、美羅培南藥物紙片購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司;多種抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品為中國(guó)藥品生物制品鑒定所產(chǎn)品;EtestMBL確認(rèn)紙條購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司;細(xì)菌DNA提取試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司;聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑購(gòu)自寶生物工程有限公司;OMEGA質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA生物技術(shù)公司;LambdaDNA-PFGEMarkers為美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品;凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品),DYY-Ⅲ8A穩(wěn)壓穩(wěn)流定時(shí)電泳儀(北京六一儀器廠),TermoCycleS1000PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)BIO-RAD公司),脈沖場(chǎng)電泳儀(BIORADCHEF-DRⅡ型)。1.2方法1.2.1菌株對(duì)多種抗菌藥物的最低抑菌濃度采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的紙片擴(kuò)散法(Kirby-Bauer)和瓊脂稀釋法測(cè)定菌株對(duì)多種抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC)值;結(jié)果根據(jù)CLSI2010年版標(biāo)準(zhǔn)1.2.2產(chǎn)碳酪氨酸酶表型測(cè)定改良Hodge法1.2.3pcr擴(kuò)增條件參考文獻(xiàn)[3]合成6對(duì)金屬β-內(nèi)酰胺酶基因引物,見表1。采用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取DNA模板,PCR反應(yīng)體系為50μL,其中TaKaraPremixTaq酶25μL,DNA4μL,上下游引物各1μL,滅菌超純水19μL。擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性10min;94℃變性60s,60℃退火30s,72℃延伸30s,共35個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。取5μLPCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察結(jié)果,用凝膠成像系統(tǒng)照相保存。目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海英濰捷基有限公司測(cè)序。DNA序列用NCBI網(wǎng)站()的BLAST比對(duì)確定基因型。1.2.4在聯(lián)合實(shí)驗(yàn)中，測(cè)定了質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移和pcr質(zhì)量粒的pcr試驗(yàn)產(chǎn)IMP-8金屬酶的肺炎克雷伯菌作為供體菌,對(duì)疊氮鈉耐藥的大腸埃希菌J53Az1.2.5脈沖場(chǎng)凝膠電泳挑取新鮮單個(gè)菌落接種至5mLLB肉湯中,37℃振蕩過夜。菌懸液離心沉淀后與1.5mLPIV緩沖液混勻,使細(xì)菌濁度為4MCF。取600μL菌液加入已融化的等體積的1.6%低熔點(diǎn)膠充分混勻后倒入模具制成凝膠塊。將凝膠塊投入EC-lisis緩沖液中37℃輕振蕩5h后,換成ESP緩沖液50℃輕振蕩水浴過夜。TE洗滌膠塊3次,切下2~3mm大小膠塊,浸入酶切體系(含XbaⅠ酶1500U4μL)中,37℃水浴酶切過夜。電泳參數(shù)為6V/cm,脈沖時(shí)間4~40s,14℃,120°夾角,電泳時(shí)間20h。電泳結(jié)束后EB染色,凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。PFGE結(jié)果判讀按Tenover等2結(jié)果2.1菌株組成和菌株3297株腸桿菌科細(xì)菌中,對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的菌株共41株,其中肺炎克雷伯菌14株,陰溝腸桿菌12株,大腸埃希菌10株,產(chǎn)酸克雷伯菌3株,奇異變形桿菌和黏質(zhì)沙雷菌各1株。腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥率逐年上升,但大部分大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌目前仍對(duì)碳青霉烯類抗生素敏感,見表2。2.2產(chǎn)碳青霉烯酶表型陽(yáng)性菌株41株耐碳青霉烯類抗生素的腸桿菌科細(xì)菌中,改良Hodge試驗(yàn)陽(yáng)性的菌株為產(chǎn)碳青霉烯酶表型陽(yáng)性株,共14株,其中肺炎克雷伯菌7株,陰溝腸桿菌5株,大腸埃希菌2株。見圖1。14株改良Hodge試驗(yàn)陽(yáng)性的菌株中,3株IP/IPI檢測(cè)陽(yáng)性,見圖2。2.3碳青霉酶陽(yáng)性真菌對(duì)各種抗菌藥物的抗性采用CLSI推薦的瓊脂平板稀釋法檢測(cè)14株碳青霉烯酶表型陽(yáng)性菌株對(duì)不同抗菌藥物的耐藥性,藥敏試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)美國(guó)CLSI2010年版2.4pcr-內(nèi)酰胺酶基因的結(jié)果14株碳青霉烯酶表型陽(yáng)性菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳,未見bla2.5聯(lián)合試驗(yàn)與優(yōu)質(zhì)粒pcr試驗(yàn)結(jié)果3株攜帶bla2.6pfga分類結(jié)果3株攜帶bla2.7產(chǎn)一次bla3植物攜帶bla3青霉烯類藥物的耐藥機(jī)制碳青霉烯類抗生素是治療革蘭陰性桿菌感染最有效的抗菌藥物,但隨著近年來其在臨床的廣泛使用,該院2007—2011年腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥性逐年上升,其中以肺炎克雷伯菌為主。碳青霉烯酶是指能夠明顯水解亞胺培南或美羅培南等碳青霉烯類抗生素的一類β-內(nèi)酰胺酶,包括Ambler分子結(jié)構(gòu)分類的A、B、D三類酶,其中B類為金屬酶,屬于Bush分群中的第3組,能水解青霉素類、頭孢菌素類和碳青霉烯類抗生素,不能被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑他唑巴坦、克拉維酸抑制,對(duì)氨曲南無水解活性,可被EDTA等金屬螯合劑抑制,其耐藥譜較A、D類酶范圍廣,且基因型最多,世界分布范圍較A、B類酶更廣自1991年日本學(xué)者在銅綠假單胞菌中發(fā)現(xiàn)第1株質(zhì)粒介導(dǎo)的金屬酶IMP-1后,現(xiàn)在已報(bào)