腫瘤化療耐藥性機理(腫瘤學基礎)課件

腫瘤化療耐藥性機理

及腫瘤化療敏感性檢測腫瘤化療耐藥性機理

及腫瘤化療敏感性檢測1一.腫瘤化療耐藥性(一)概述化療作為全身性治療的手段，在惡性腫瘤的治療中具有手術和放療不能替代的地位。1946年Gillman和Phillips報道氮芥類藥物治療造血系統(tǒng)腫瘤以來，化療已取得長足進步。50年代氟脲嘧啶、環(huán)磷酰胺，70年代順鉑的開發(fā)都成為化療史上的里程碑，目前臨床應用的抗腫瘤藥物已達60余種。通過不懈的基礎與臨床研究，揭示了化療的部分規(guī)律，形成了現(xiàn)行的聯(lián)合用藥、大劑量間斷給藥、多途徑多方式給藥等有助于提高療效的治療策略。一.腫瘤化療耐藥性2

目前化療已使絨癌、惡性葡萄胎、何杰金病、睪丸精原細胞瘤等獲得治愈的機會，使乳腺癌、兒童淋巴瘤、神經母細胞瘤、骨肉瘤等得以緩解，存活期得到延長，從而化療成為惡性腫瘤治療的主要手段之一。但臨床抗腫瘤藥物治療的總有效率僅14％。阻礙化療取得更好療效的原因是：1.現(xiàn)行化療的盲目性、憑經驗治療：個體化治療2.化療的耐藥性：設法防治耐藥、逆轉耐藥性3.抗腫瘤藥物的毒性：聯(lián)合用藥等措施目前化療已使絨癌、惡性葡萄胎、何杰金病、睪丸精原3(二)耐藥性類型：先天性耐藥(naturalresistance):腫瘤一開始就對抗腫瘤藥物有耐藥性，主要與藥理學、生物化學和腫瘤細胞增殖動力學有關。獲得性耐藥(acquiredresistence)：腫瘤最初對抗腫瘤藥物敏感，應用后產生的耐藥性。根據(jù)耐藥譜分為：原藥耐藥(primarydrugresistence,PDR)：只對原抗腫瘤藥物產生耐藥，而對其他抗腫瘤藥物不產生交叉耐藥。多藥耐藥(multipledrugresistence.MDR)：由一種抗腫瘤藥物誘發(fā)，但同時又對其他多種結構和功能差異的抗腫瘤藥物產生交叉耐藥。(二)耐藥性類型：4(三)多藥耐藥產生機理：1.谷胱甘肽(glutathione,GSH)和谷胱甘肽-S-轉移酶(glutathione-s-transferase,GST)

GSH與GST密切配合啟動腫瘤細胞內解毒機制而使化療藥物失活，參與耐藥機理的形成。如苯丙酸氮芥、環(huán)磷酰胺、順鉑、阿霉素、絲裂霉素等。胞內GSH濃度與γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)、谷胱甘肽合成酶(GS)、谷胱甘肽還原酶(GR)活性有關；與谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸的含量有關。GSH含量及相關酶：GST、γ-GCS、GS、GR活性是GSH引起耐藥的相關因子。(三)多藥耐藥產生機理：5具體機理：

①GST可催化GSH與親電性抗腫瘤藥物迅速結合，加速抗腫瘤藥物的降解，使藥物在靶部位的積蓄迅速減少，從而達不到致死濃度。②GST可催化親脂性抗腫瘤藥物與膽紅素及甾體化合物等結合，加速藥物的排泄，并保護膜脂質成分免受自由基等損傷。③清除細胞毒性代謝產物，如過氧化物和自由基被GSH還原成毒性較低醇類物質。④阻止藥物與靶細胞DNA結合，并加強對損傷DNA的修復能力，降低抗腫瘤藥物的細胞毒作用。具體機理：6

2.P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp):

P-gp由多藥耐藥基因(mdr)編碼分子量為17KD，具有能量依賴性藥泵跨膜糖蛋白。使ATP水解成ADP，釋放能量，并在Mg2+的作用下，與細胞內抗腫瘤藥物結合并運輸?shù)郊毎?，P-gp可將親脂類化療藥物泵出細胞外，也可能同時存在多種藥物結合點而將多種藥物泵出細胞外，引起耐藥。P-gp高表達伴隨預后不良，可作為腫瘤患者預后評價的指標。P-gp也可存在許多正常組織：腦、肺、肝、腎、結腸等處。2.P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp7

3.多藥耐藥相關蛋白(mulitidrugrelatedprotein,MRP)分子量為19KD的能量依賴性藥泵跨膜糖蛋白，MRP增高可將帶負電荷藥物如阿霉素、表阿霉素、Vp16、長春新堿、長春花堿、放線菌素等泵出細胞；MRP能識別并轉運與GSH耦合的底物；MRP能使細胞內藥物分布發(fā)生改變，使重要的攻擊靶點（胞核）藥物減少，從而產生耐藥。3.多藥耐藥相關蛋白8

4.拓撲異構酶(topoisomerase,TOPO)

TOPO是催化DNA拓撲結構改變的酶，即引起DNA二維、三維結構改變的酶系統(tǒng)。它直接參與細胞的增殖，與DNA復制、轉錄、姊妹染色體的分離及基因的表達密切相關，可以影響細胞許多重要的生物學功能，是細胞維持正常生理活動所必需的酶。

TOPO根據(jù)其斷裂DNA單鏈或雙鏈而分為Ⅰ、Ⅱ。

TOPOⅠ是喜樹堿、蒽環(huán)類抗腫瘤藥物的重要靶點，TOPOⅡ是許多插入物、Vp16等的重要靶點。這些藥物通過該酶與DNA交鏈形成共價復合物，引起DNA永久性損傷，導致腫瘤細胞死亡。若該酶含量減少，活性降低，復合物形成減少而產生耐藥。4.拓撲異構酶(topoisomerase,TOPO)9

5.肺耐藥蛋白

(lungresistancepyotein,LRP)LRP為分子量110KD穹窿蛋白（穹窿作為胞漿中的一種細胞器，所含的核糖蛋白顆粒50％為LRP）。LRP可能介導順鉑、卡鉑、烷化劑等一些P-gp和MRP不能介導的藥物從核到胞漿重新分布因而產生耐藥。5.肺耐藥蛋白10

6.二氫葉酸還原酶(dihydrofolatereductase,DHFR)DHFR分子量為22KD，是細胞內葉酸代謝的關鍵酶，能催化二氫葉酸還原成四氫葉酸，四氫葉酸在胸腺嘧啶合成酶作用下參與DNA、RNA、蛋白質的合成。氨甲碟呤(MTX)是一種葉酸類似物，能競爭性地與靶酶DHFR的活性位點結合而使其失活，導致細胞內四氫葉酸含量下降，細胞DNA合成異常，引起細胞死亡。MTX產生耐藥因素與DHFR基因突變有關。6.二氫葉酸還原酶117.O6-烷基鳥嘌呤DNA烷基轉移酶

(O6-alkylguanineDNAalkyltransferase,AGT)

AGT由甲基鳥嘌呤轉移酶基因編碼，AGT能修復損傷DNA，即修復許多烷化劑類抗腫瘤藥物所誘導形成O6-烷基鳥嘌呤DNA加成物，因而使腫瘤細胞產生耐藥。7.O6-烷基鳥嘌呤DNA烷基轉移酶12

8.醛脫氫酶(aldehydrase,ALDH)環(huán)磷酰胺（CTX）進入人體后在肝臟內經P450羥化形成4-羥環(huán)磷酰胺，它與醛磷酰胺存在互變異構，醛磷酰胺經歷一次β消除反應，形成丙烯醛與磷酰胺芥。磷酰胺芥對腫瘤細胞產生細胞毒作用，而ALDH能將醛磷酰胺氧化成無毒性的羧基磷酰氨，不對腫瘤細胞產生細胞毒作用，從而出現(xiàn)腫瘤細胞耐藥。8.醛脫氫酶(aldehydrase,ALDH)13

9.蛋白激酶C(protrinkinaseC,PKC)

PKC是一種Ca2+、磷脂依賴性蛋白質激酶，使多種蛋白質的絲氨酸、蘇氨酸殘基磷酸化，影響細胞內生物信息的傳導，在調節(jié)細胞代謝、分化、增殖、癌變中具有重要作用。在MDR細胞中加入維拉帕米、三氟拉嗪，細胞內PKC活性降低50％，MDR出現(xiàn)完全或部分逆轉。

PKC在MDR中的機理是增加P-gp的磷酸化，而P-gp磷酸化是其依賴ATP向細胞外轉運藥物的必要條件。用PKC抑制劑H7可使P-gp磷酸化程度降低30％；用PKC激活劑可加速P-gp磷酸化。9.蛋白激酶C(protrinkinaseC,P1410.凋亡基因失活與抗凋亡基因激活

凋亡基因bax、bcl-Xs、p53等失活；抗凋亡基因bcl-2、bcl-Xl、ber/abl等激活，Bcl-2蛋白過表達可通過抑制P53蛋白活性、抑制c-myc誘導的凋亡、與Bax蛋白形成異二聚體等途徑導致腫瘤細胞對許多化療藥物誘導的凋亡不敏感，參與腫瘤細胞多藥耐藥。10.凋亡基因失活與抗凋亡基因激活15(四)多藥耐藥模型的建立1.體外耐藥細胞系的建立：藥物濃度遞增持續(xù)作用法、大劑量藥物間歇誘導法、采用轉基因方法。2.體內耐藥細胞系的建立：(四)多藥耐藥模型的建立16(五)耐藥株細胞檢測1.細胞形態(tài)變化：光鏡、電鏡觀察2.細胞生長曲線：計算群體倍增時間3.耐藥指數(shù)：耐藥株IC50/親代株IC504.細胞染色體檢測：染色體均勻染色區(qū)、雙微核。5.免疫細胞化學法：P-gp、MRP、GST-π、bcl-2等。(五)耐藥株細胞檢測176.細胞內酶的測定：O6-烷基鳥嘌呤DNA烷基轉移酶、谷胱甘肽和谷胱甘肽-S-轉移酶測定7,流式細胞儀測定：P-gp、bcl-2等及細胞周期分布8.細胞內藥物濃度測定：用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀測定細胞內鉑、阿霉素等濃度。9.多藥耐藥基因mRNA的檢測：PCR、Northern印跡分析、原位雜交等。10.耐藥株穩(wěn)定性測定：細胞凍存與復蘇6.細胞內酶的測定：O6-烷基鳥嘌呤DNA烷基轉移酶、谷胱甘18二抗癌藥物敏感試驗(anti-cancerdrugsensitivitytest)(一)分類1.體內法：雞胚接種移植法、動物眼前房移植法、裸鼠及標準動物的腎包膜下移植法等。它們不脫離腫瘤生長的體內環(huán)境、在組織學和細胞動力學方面都與人體腫瘤內一致，因而使試驗結果與臨床的符合率高。2.體外法：人癌干細胞克隆形成測定法（HTCA）、四唑氮藍顯色反應法（MTT法）、同位素摻入法、ATP生物發(fā)光法、琥珀酸脫氫酶抑制法、染料排除法、流式細胞儀法、PCR法等。它們具有快速、簡便、與臨床相關性好、重復性好等優(yōu)點。二抗癌藥物敏感試驗19

(二)四唑氮藍顯色反應藥敏試驗（MTT法）1.原理：利用活細胞內線粒體脫氫酶能將MTT轉化為藍紫色衍生物(formazan)的原理來檢測活細胞數(shù)目。產物顏色深淺（可用吸光值表示）與活細胞數(shù)成正比，吸光值可以在自動酶標儀上連續(xù)記數(shù)，測定出腫瘤細胞未用藥與用藥的吸光值，計算出腫瘤細胞存活率，從而預測患者體內腫瘤細胞對某種抗腫瘤藥物敏感程度。(二)四唑氮藍顯色反應藥敏試驗（MTT法）202.方法：計算：實驗組吸光值腫瘤細胞存活率＝腫瘤細胞對照組吸光值腫瘤細胞抑制率＝1－腫瘤細胞存活率結果判定：腫瘤細胞抑制率>70％該藥高度敏感腫瘤細胞抑制率50－70％該藥中度敏感腫瘤細胞抑制率<50％該藥不敏感2.方法：21應用：腫瘤患者個體化治療中的作用：實體瘤、胸腹水、骨髓血、外周血等。其他方面應用：逆轉耐藥測試，篩選新抗治療藥物（抗癌譜、半致死量等），其他細胞毒作用的藥物如細胞因子、反義核苷酸的作用檢測，新合成人類替代材料對正常細胞的毒性作用。應用：22影響因素及注意事項：1.腫瘤細胞的病理類型2.腫瘤標本取材部位3.腫瘤標本污染4.腫瘤細胞純度問題影響因素及注意事項：23存在問題：1.誤差問題2.在體