奶油栓孔菌子實體多糖的化學性質及酒精性肝損傷的保護作用

奶油栓孔菌子實體多糖的化學性質及酒精性肝損傷的保護作用

酒精性肝病（ald）是由長期飲酒引起的肝臟損傷性疾病，包括從脂肪變質到肝硬化的廣泛肝臟病變。奶油栓孔菌Trameteslactinea是隸屬于擔子菌門Basidiomycota、傘菌綱Agaricomycetes、多孔菌目Polyporales、多孔菌科Polyporaceae、栓孔菌屬Trametes的一種大型真菌，其子實體一年生，硬木栓質至木栓質，是我國熱帶地區(qū)一種常見的大型真菌（1材料和方法1.1材料、試劑和機器1.1.1tratelact三維培養(yǎng)奶油栓孔菌子實體采自福建省南平市浦城仙芝樓靈芝基地，經鑒定為奶油栓孔菌Trameteslactinea；昆明種小鼠40只，由吳氏實驗動物在線提供（/xieli/），體重18–22g，雄性。1.1.2試劑和試劑盒1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（ABTS）、2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ）和抗壞血酸（VC）均為國產分析純；聯(lián)苯雙酯滴丸由北京協(xié)和藥廠提供；谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；蘇木素-伊紅染液試劑盒由江蘇凱基生物技術股份有限公司提供；UV-vis1800紫外可見分光光度計（島津實驗器材有限公司）；VarioskanFlash多功能酶標儀（美國Thermo公司）；NicoletiS50傅立葉變換紅外光譜儀（美國Thermo公司）；BX43生物正置顯微鏡（日本Olympus公司）。1.2方法1.2.1分離純化蛋白質將奶油栓孔菌子實體烘干后粉碎，取適量子實體粉末按料液比1:30加入去離子水，置90℃水浴鍋中提取4h，重復提取2次，合并兩次提取液，加入3倍體積的無水乙醇，于4℃冰箱中靜置過夜，離心收集沉淀，用去離子水復溶，用Sevage試劑（氯仿:正丁醇=4:1）進行脫蛋白質直至無沉淀，離心取上清液。將多糖溶液裝入透析袋中連續(xù)流水透析48h，除去小分子物質，將透析后的多糖溶液凍干，得到奶油栓孔菌子實體多糖（TLFPS）。1.2.2化學組成分析總糖含量采用苯酚-硫酸法（1.2.3紫外吸收光譜測定多糖樣品配制成0.25mg/mL的溶液，利用紫外-可見分光光度計在190–300nm范圍內掃描，掃描間距為1nm。1.2.5剛果紅試驗參考1.2.6活性測定DPPH自由基清除活性測定：參考AABTS自由基清除活性測定：參考A超氧陰離子自由基清除活性測定：超氧陰離子自由基清除能力測定參照A鐵離子還原能力測定：參照1.2.7小鼠肝功能指標的測定動物分組和處理：將購買的40只雄性小鼠隨機分成4組，每組10只，分別為空白組、模型組、多糖組（200mg/kgTLFPS）和陽性對照組（300mg/kg聯(lián)苯雙酯）。適應性喂養(yǎng)一周后，對照組和模型組小鼠灌喂蒸餾水，多糖組和陽性對照組小鼠按對應劑量灌喂給藥8d，期間自由進食。參照小鼠的醉酒與醒酒時間測定：參考小鼠肝指數及其血清ALT、AST、TC、TG指標的測定：解剖前稱量體重，解剖后稱量肝臟總重，小鼠肝指數=肝臟總重/體重×100%，從小鼠眼球部位取血，經3500r/min離心后取上層血清備用，根據試劑盒說明書要求測定血清ALT、AST、TC、TG的水平。肝臟MDA、CAT、SOD指標的測定：稱取小鼠肝組織制成10%的勻漿液，5000r/min離心，取上清液備用，根據MDA、CAT、SOD試劑盒說明書要求分別測定MDA、CAT、SOD的水平。肝組織病理學觀察：取各組肝左葉中部切片用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅染液試劑盒染色后，在200倍顯微鏡下進行觀察并拍照。1.3數據的統(tǒng)計與分析數值用uf060x±s表示，數據分析采用SPSS20.0軟件，P<0.05和P<0.01表示顯著差異和極顯著差異。2結果與分析2.1tlfps的化學成分分析比色法測定結果顯示多糖含有較高糖醛酸含量和硫酸根含量，并且結合有微量蛋白質（表1）。2.2tlfps多糖類物質紫外-可見光譜掃描結果見圖1，在195nm處有明顯吸收峰，這是多糖的特征吸收峰，表明TLFPS屬于多糖類物質。在280nm波長附近有微弱吸收峰，表明經脫蛋白處理后，仍有少量蛋白與多糖緊密結合（2.3tlfps紅外光譜分析紅外光譜分析結果顯示，在3412.00cm2.4tlfps三螺旋結構分析剛果紅能與具有三股螺旋構象的多糖形成絡合物，與不加多糖的剛果紅溶液相比最大吸收波長（λ2.5dpph、abts、鐵離子還原能力本研究通過測定DPPH、ABTS、超氧陰離子自由基的清除活性和鐵離子還原能力來評價奶油栓孔菌子實體多糖（TLFPS）體外的抗氧化能力。DPPH的清除活性隨多糖濃度的增加而增加，表現(xiàn)出良好的量效關系，當多糖濃度為4mg/mL時，DPPH的清除率達到了(79.64±0.37)%（圖4A）。對ABTS的清除能力見圖4B，當多糖濃度為1mg/mL時，ABTS的清除率達到了陽性對照VC的水平。隨著多糖濃度的增加，超氧陰離子清除率平緩上升，在濃度為4mg/mL時，超氧陰離子的清除率達到(43.57±2.03)%（圖4C）。對鐵離子還原能力見圖4D，其可以反映樣品總的還原力，還原能力體現(xiàn)在FRAP值上，F(xiàn)RAP值越大還原能力越強。結果顯示鐵離子還原能力隨多糖濃度增加呈劑量依賴性，當濃度為4mg/mL時，其FRAP值達到(0.50±0.003)mmol/L。綜上所示，奶油栓孔菌子實體多糖作為一種天然產物具有較強的體外抗氧化能力，該結果為即將開展的體內生物活性實驗奠定了良好的基礎。2.6小鼠稱重測定將提取純化的子實體粗多糖用于急性酒精性肝損傷小鼠實驗，在實驗期間，每隔一天對各組實驗小鼠進行稱重。與空白組相比，模型組、多糖組以及陽性對照組的小鼠體重無顯著性差異（P>0.05）（表2），這表明實驗所用試劑劑量適當，對小鼠的生長發(fā)育不構成影響，同時也表明TLFPS對小鼠健康無影響，對小鼠無毒副作用。2.7tlfps對急性酒精肝臟損傷大鼠飲酒和飲酒時間的影響小鼠酒精中毒后會產生翻正反射現(xiàn)象，是檢測小鼠酒精中毒的指標之一（2.8tlf有助于降低小鼠的肝臟重量和肝臟指數肝指數可反映肝的病變情況，一旦肝臟受損就會導致肝指數發(fā)生明顯變化（2.9小鼠血清中ast、alt、tg、tc的變化情況AST、ALT、TG和TC都是檢測肝損傷的重要指標，當細胞損傷時血清中的含量會大量增長。對小鼠血清AST、ALT、TG和TC的研究見圖6，與空白組相比，模型組小鼠血清中AST、ALT、TG和TC水平均顯著提高（P<0.01），這說明小鼠肝細胞受到嚴重破壞，致使小鼠體內ALT、AST、TG和TC代謝平衡被破壞，大量進入血液中使得血液中的含量顯著升高。與模型組相比，奶油栓孔菌子實體多糖能夠明顯地降低急性酒精肝損傷小鼠的AST(P<0.05）、ALT(P<0.01）、TG(P<0.01）和TC水平（P<0.01），結果反映出奶油栓孔菌子實體多糖對乙醇誘導的小鼠急性酒精性肝損傷有良好的緩解作用。2.10乙醇對小鼠肝臟抗氧化能力的影響MDA、SOD和CAT是檢測肝損傷的重要指標，能反映機體肝組織的氧化損傷程度。對小鼠肝臟MDA、SOD和CAT的研究結果見圖7，與空白組相比，模型組小鼠肝臟中MDA水平明顯提高（P<0.01),SOD、CAT活性顯著下降（P<0.01），表明給予乙醇會造成小鼠肝損傷，肝損傷小鼠抗氧化能力大幅度降低。與模型組相比，奶油栓孔菌子實體多糖能夠明顯地降低酒精肝損傷小鼠的肝MDA水平（P<0.01），提高SOD、CAT活性（P<0.05），表明奶油栓孔菌子實體多糖能夠緩解酒精造成的氧化應激損傷，對小鼠急性酒精性肝損傷具有一定的預防保護作用。2.11竇無明顯溶血在檢測小鼠酒精性肝損傷指標以后，進一步觀察不同組小鼠肝組織的變化情況?？瞻捉M（A）小鼠肝小葉結構清晰，肝細胞索排列整齊，呈放射狀，肝細胞結構清晰，沒有泡沫狀改變，肝竇無明顯充血。與空白組相比，模型組（B）小鼠肝小葉界限不清，肝細胞索排列紊亂，肝竇變窄，肝細胞出現(xiàn)濁腫，泡沫或氣球樣改變，胞漿淡染，細胞核模糊不清。肝竇出現(xiàn)明顯的充血現(xiàn)象。與模型組相比，多糖組（C）顯著改善肝細胞濁腫及泡沫樣改變，對肝細胞索紊亂有一定的改善作用，陽性對照組（D）肝細胞索排列明顯改善，肝小葉界限明顯，肝細胞濁腫及泡沫樣改變明顯改善，肝臟病理組織觀察結果也說明了奶油栓孔菌子實體多糖（TLFPS）對急性酒精性肝損傷具有很好的預防效果，而陽性藥也能達到該種程度的效果，甚至更佳（圖8）。3tlfps的臨床應用本研究通過比色法測得奶油栓孔菌子實體多糖有較高的糖醛酸含量(103.45±0.71)mg/g，研究表明多糖中糖醛酸含量越高，清除氧自由基的能力更強，抗氧化能力就越強（肝臟是人體最大的腺體器官，極易受有毒化學物質損傷，造成肝臟代謝功能紊亂。大量酒精攝入會導致脂肪肝、肝炎、肝硬化，目前肝損傷已成為了尤為突出的全球性健康問題（本研究以50%乙醇灌喂小鼠建立急性酒精性肝損傷模型，探究奶油栓孔菌子實體多糖（TLFPS）在體內對酒精性肝氧化損傷的保護效果。在健康肝臟中ALT、AST很高，而血液中含量很低，一旦肝臟細胞受損，大量ALT和AST就會釋放到血清中使血清中含量升高，ALT與AST水平的高低在一定范圍內反映機體肝細胞的損傷程度（