【課件】微生物的選擇培養(yǎng)與計(jì)數(shù)課件高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

1.2.2微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)1973年，科學(xué)家從美國(guó)黃石國(guó)家公園的熱泉中篩選出水生棲熱菌(Thermusaquaticus)，進(jìn)而從這種菌中提取出耐高溫的DNA聚合酶。這種酶目前已被廣泛用于體外擴(kuò)增DNA片段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。1.為什么水生棲熱菌能更容易在熱泉中找到并被篩選出來呢？這是因?yàn)樗鷹珶峋m應(yīng)熱泉的環(huán)境，能在70~80℃的高溫條件下生存，而絕大多數(shù)微生物在此條件下不能生存。2.在自然界中，想進(jìn)行微生物篩選的原則是什么？耐熱微生物耐寒微生物石油分解菌根據(jù)微生物對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)環(huán)境中去尋找。實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選，也可以應(yīng)用同樣的原理，即人為提供有利于目的菌生長(zhǎng)的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度和pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物的生長(zhǎng)。選擇培養(yǎng)基：在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，稱為選擇培養(yǎng)基。不加碳源的培養(yǎng)基分離出自養(yǎng)微生物分離耐熱菌70～80℃的高溫不加氮源的培養(yǎng)基分離固氮微生物加青霉素的培養(yǎng)基分離真菌一、選擇培養(yǎng)基加高濃度食鹽分離金黃色葡萄球菌

改變培養(yǎng)條件

添加某種化學(xué)物質(zhì)

營(yíng)養(yǎng)缺陷尿素[CO(NH2)2]尿素[CO(NH2)2]含氮量高，化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一種重要的氮肥，尿素不能直接被農(nóng)作物吸收，尿素施入土壤中，需要土壤中的細(xì)菌將尿素分解成NH3，NH3再轉(zhuǎn)化為NO3-、NH4+等被植物利用。思考·討論

選擇培養(yǎng)基配方的設(shè)計(jì)

CO(NH2)2+H2O2NH3+CO2

脲酶一、選擇培養(yǎng)基而這些細(xì)菌之所以能分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕浮ｋ迕复呋蛩胤纸猱a(chǎn)生NH3，NH3可作為細(xì)菌生長(zhǎng)的氮源尿素[CO(NH2)2]1.如果讓你配制一種培養(yǎng)基，將土壤稀釋液中能分解尿素的細(xì)菌分離出來，培養(yǎng)基的配方該如何設(shè)計(jì)？尿素作為唯一氮源這種培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基相比，只是用尿素作為唯一氮源，其他營(yíng)養(yǎng)成分基本相同。思考·討論

選擇培養(yǎng)基配方的設(shè)計(jì)

一、選擇培養(yǎng)基1g土壤中有多少能分解尿素的細(xì)菌?2.該培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基有哪些共同點(diǎn)和不同點(diǎn)？二、微生物選擇培養(yǎng)通過對(duì)土樣進(jìn)行充分稀釋，再將菌液涂布到制備好的培養(yǎng)基上，即可得到能分解尿素的細(xì)菌的純培養(yǎng)物（單菌落）。稀釋涂布平板法兩個(gè)基本操作：梯度稀釋和涂布平板稀釋涂布平板法的具體操作步驟?稀釋涂布平板法①鏟取土樣，將樣品裝入紙袋中。90mL無菌水9mL無菌水②將10g土樣加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。

注意：取土樣時(shí)用的鐵鏟和取樣袋在使用前都需要滅菌。操作完成后，一定要洗手。稀釋10倍梯度稀釋③取0.1mL菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。④將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。⑤將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡，涂布器冷卻后，再進(jìn)行涂布。⑥用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時(shí)可轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使涂布均勻。涂布平板瀝干移液槍稀釋涂布平板法培養(yǎng)與觀察：待涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置，放入30～37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2d。稀釋涂布平板法除可以用于分離微生物外，稀釋涂布平板法稀釋涂布平板操作后分離得到單菌落也常用來統(tǒng)計(jì)樣品中活菌的數(shù)目。三、微生物的數(shù)量測(cè)定——稀釋涂布平板法保證合理稀釋度統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目少每克樣品中的活菌數(shù)≈808278（80/0.1）×105實(shí)際土樣中活菌數(shù)目要

8×107

大于當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。通過統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌。2.同一稀釋度至少對(duì)3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，求平均值（要分析3個(gè)重復(fù)值得差值大?。┍M量減少誤差每克樣品中的活菌數(shù)≈(C÷V)×MC：平板上平均菌落數(shù)；V：涂布所用體積(mL)；M：稀釋倍數(shù)。1.選擇30-300個(gè)菌落的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。3.涂布要均勻三、微生物的數(shù)量測(cè)定——顯微鏡直接計(jì)數(shù)是一種常用的、快速直觀的測(cè)定微生物數(shù)量的方法。利用特定的細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)，然后再計(jì)算一定體積的樣品中微生物的數(shù)量，統(tǒng)計(jì)的結(jié)果一般是活菌數(shù)和死菌數(shù)的總和。也可選擇用臺(tái)盼藍(lán)染色法來區(qū)分活菌和死菌。還有其他的微生物計(jì)數(shù)法嗎？三、微生物的數(shù)量測(cè)定——其他方法當(dāng)空氣或者水樣較為純凈，微生物濃度較低時(shí)，如何計(jì)數(shù)？濾膜法比濁法在一定范圍內(nèi)，菌液的渾濁度與菌的數(shù)量成正比（不分死活菌）（活菌）分光光度計(jì)探究實(shí)踐：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)絕大多數(shù)微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，可以從土壤中分離出分解尿素的細(xì)菌?；A(chǔ)知識(shí)：選擇培養(yǎng)基配方：在該培養(yǎng)基上的菌落一定是能分解尿素的細(xì)菌嗎？不一定，比如固氮菌；還有些微生物可以利用目的菌的代謝產(chǎn)物來生長(zhǎng)繁殖。因此還需要進(jìn)一步的鑒別。鑒別培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品(不影響微生物正常生長(zhǎng))，使微生物的某種代謝產(chǎn)物與之發(fā)生(不)反應(yīng)而達(dá)到鑒定的作用。P20：在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅就是一種鑒別培養(yǎng)基（出現(xiàn)透明圈）。

細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解為NH3

，NH3會(huì)使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，pH升高，因此可以通過檢測(cè)培養(yǎng)基pH的變化來判斷是否發(fā)生了該化學(xué)反應(yīng)，進(jìn)而判斷該菌是否為尿素分解細(xì)菌。CO(NH2)2+H2O2NH3+CO2

脲酶NH3

(堿性)，使酚紅指示劑呈

色。紅

在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）中加入酚紅指示劑（鑒別培養(yǎng)基），培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果指示劑變紅，說明該細(xì)菌就是能夠分解尿素的細(xì)菌。探究實(shí)踐：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)土壤中含有能分解尿素的細(xì)菌，我們?nèi)绾畏蛛x它們？每克土壤樣品究竟含有多少這樣的細(xì)菌？提出問題作出假設(shè)實(shí)施實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果表達(dá)與交流利用以尿素作為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基并加入酚紅指示劑，進(jìn)行可以分離和計(jì)數(shù)。1.土壤取樣2.制備培養(yǎng)基3.樣品稀釋與取樣涂布4.微生物的培養(yǎng)與觀察探究實(shí)踐：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)（1）土壤取樣①取樣地點(diǎn)要求：酸堿度接近中性的潮濕土壤。②取樣過程：鏟去表層土（一般3cm左右）。①細(xì)菌：一般用104、105、106稀釋液。③真菌：一般用102、103、104稀釋液。（3）樣品稀釋與取樣涂布以保證獲得菌落數(shù)在30～300之間適于計(jì)數(shù)的平板。

選擇一個(gè)比較寬的范圍，將1×103～1×107倍稀釋的稀釋液分別涂布到平板上培養(yǎng)，以保證能從中選擇出菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。在初次實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于稀釋的范圍沒有把握，怎樣做才能保證從中選擇出菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)？相當(dāng)于做預(yù)實(shí)驗(yàn)。（2）制備培養(yǎng)基（4）微生物的培養(yǎng)與觀察①培養(yǎng)條件：不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間。細(xì)菌一般在30～37℃的溫度下培養(yǎng)1～2d。②觀察：每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果。防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。③一般來說，在相同的培養(yǎng)條件下，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征，如形狀、大小和顏色等。（鑒別指示劑）探究實(shí)踐：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)1.結(jié)合對(duì)照組，分析培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出一些菌落。①判斷培養(yǎng)基是否有雜菌污染：放入未接種的培養(yǎng)基；②判斷選擇培養(yǎng)基是否有篩選作用：放入接種后的完全培養(yǎng)基。2.你是否獲得了某一稀釋度下菌落數(shù)為30~300的平板？在這一稀釋度下，是否至少有2個(gè)平板的菌落數(shù)接近？如果得到了兩個(gè)或多個(gè)菌落數(shù)為30～300的平板，說明稀