CRISPR–Cas系統(tǒng),基因組改造新技術(shù)

CRISPR-Cas系統(tǒng)，基因組改造新技術(shù)有一種細(xì)菌編碼的酶能夠利用向?qū)NA(guideRNA)分子對(duì)特定的DNA片段進(jìn)行定向切割，科學(xué)家們利用這種特點(diǎn)開(kāi)發(fā)出了一種能夠?qū)蚪M進(jìn)行特異性定點(diǎn)改造的工具，對(duì)細(xì)胞乃至整個(gè)生物體進(jìn)行基因組改造。目前已經(jīng)利用這種技術(shù)對(duì)細(xì)菌、人體細(xì)胞以及斑馬魚進(jìn)行過(guò)成功的遺傳學(xué)改造工作。日本大阪大學(xué)(OsakaUniversity)的科研人員們?cè)?jīng)在1987年發(fā)表過(guò)一篇論文，不過(guò)這篇論文在當(dāng)時(shí)并沒(méi)有引起太多人的注意，只不過(guò)是一篇普普通通的小文章。這幫大阪大學(xué)的科學(xué)家當(dāng)時(shí)正在對(duì)一種細(xì)菌編碼的堿性磷酸酶(alkalinephosphatase)基因進(jìn)行研究，不過(guò)他們?cè)诠ぷ髦邪l(fā)現(xiàn)，在這個(gè)基因編碼區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的DNA片段，這些片段是由簡(jiǎn)單的重復(fù)序列組成的，而且在片段的兩端還存在一段不太長(zhǎng)的特有的序列。關(guān)于這樣一個(gè)重復(fù)序列他們當(dāng)時(shí)在論文中是這樣評(píng)價(jià)白一“我們目前也不太清楚這些序列的生物學(xué)意義?！辈贿^(guò)這個(gè)在差不多三十年之前取得的不起眼的“小發(fā)現(xiàn)”在今天卻綻放出了耀眼的光芒，因?yàn)槿缃窨茖W(xué)家們正是利用這個(gè)小片段找到了一種可以對(duì)多種生物的基因組進(jìn)行遺傳改造的工具，而且這種方法操作起來(lái)還非常地簡(jiǎn)單。就在短短的一個(gè)月之內(nèi)，在包括《科學(xué)》(Scienee)和《自然生物技術(shù)》(NatureBiotechnology)等雜志上就已經(jīng)發(fā)表了5篇相關(guān)的論文介紹這個(gè)現(xiàn)在被稱作CRISPR-Cas系統(tǒng)(CRISPR-Cassystems)、簡(jiǎn)便而又實(shí)用的基因組改造新技術(shù)。近幾十年來(lái)，隨著全基因組測(cè)序技術(shù)的不斷成熟，我們?cè)诟鞣N細(xì)菌和古細(xì)菌(archaea)中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了很多成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsequences,即CRISPR序列，這就是二十多年前日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的那個(gè)序列)和CRISPR相關(guān)基因(CRISPR-associatedgenes,Casgene)。研究發(fā)現(xiàn)，這些CRISPR序列與很多病毒或者質(zhì)粒的DNA序列是互補(bǔ)的，說(shuō)明這套CRISPR-Cas系統(tǒng)很有可能是生物體抵御病毒等外來(lái)入侵者的一套特異性防御機(jī)制，就好像是另外一套適應(yīng)性免疫反應(yīng)系統(tǒng)(adaptiveimmunesystem)。后續(xù)的遺傳學(xué)試驗(yàn)和生物化學(xué)試驗(yàn)也證實(shí)了這種猜測(cè)。雖然有很多CRISPR-Cas系統(tǒng)需要多種蛋白的參與，但是在很多細(xì)菌的胞內(nèi)都只需要一種內(nèi)切酶(endonuclease)Cas9就足夠了，我們將這種CRISPR-Cas系統(tǒng)也稱作2型系統(tǒng)(typeIIsystems)，如圖1所示。Cas9內(nèi)切酶在向?qū)NA的指引下能夠?qū)Ω鞣N入侵的外源DNA分子進(jìn)行定點(diǎn)切割，不過(guò)主要識(shí)別的還是保守的間隔相鄰基序(proto-spaceradjacentmotifs，PAM基序)。如果要形成一個(gè)有功能的DNA切割復(fù)合體，還需要另外兩個(gè)RNA分子的幫助，它們就是CRISPRRNA(crRNA)和反式作用CRISPRRNA(trans-actingCRISPRRNA,tracrRNA)。不過(guò)最近有研究發(fā)現(xiàn)，這兩種RNA可以被“改裝”成一個(gè)向?qū)NA(single-guideRNA,sgRNA)。這個(gè)sgRNA足以幫助Cas9內(nèi)切酶對(duì)DNA進(jìn)行定點(diǎn)切割。最新的報(bào)道稱，在多種類型的細(xì)胞和生物體內(nèi)，這種RNA介導(dǎo)的Cas9酶切作

用能夠正常地行使功能，在完整基因組上的特定位點(diǎn)完成切割反應(yīng)。這樣就可以方便地進(jìn)行后續(xù)的基因組改造工作了。細(xì)胞通常會(huì)通過(guò)兩種方式對(duì)發(fā)生雙鏈斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù)，這兩種方式分別是同源重組修復(fù)機(jī)制(homologousrecombination,HR)和非同源末端連接修復(fù)機(jī)制(non-homologousendjoining,NHEJ)，不過(guò)在修復(fù)的過(guò)程中細(xì)胞有可能會(huì)對(duì)修復(fù)位點(diǎn)進(jìn)行修飾，或者插入新的遺傳信息。M3^ttDNA#r裂修童Q內(nèi)切酶M3^ttDNA#r裂修童Q內(nèi)切酶與基固組序列匹配基因iflDNAIIIIVEIirET■tlIIIIVEIirET■tlji人悴朗胞已/細(xì)菌細(xì)胞人悴朗胞已/細(xì)菌細(xì)胞圖1RNA介導(dǎo)的Cas9系統(tǒng)定向基因組修飾作用機(jī)制示意圖。Cas9內(nèi)切酶是一種DNA內(nèi)切酶，很多細(xì)菌都可以表達(dá)這種蛋白，Cas9內(nèi)切酶能夠?yàn)榧?xì)菌提供一種防御機(jī)制，避免病毒或者質(zhì)粒等外源DNA的侵入。Cas9內(nèi)切酶必須在向?qū)NA分子的引導(dǎo)下對(duì)DNA進(jìn)行切割，這是因?yàn)檫@些向?qū)NA分子含有與靶DNA序列互補(bǔ)的序列，我們稱之為PAM序列。Cas9內(nèi)切酶在向?qū)NA分子的引導(dǎo)下對(duì)特定位點(diǎn)的DNA進(jìn)行切割，形成雙鏈DNA缺口，然后細(xì)胞會(huì)借助同源重組機(jī)制(homologousrecombination)或者非同源末端連接機(jī)制(non-homologousendjoining)對(duì)斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù)。如果細(xì)胞通過(guò)同源重組機(jī)制進(jìn)行

修復(fù)，會(huì)用另外一段DNA片段填補(bǔ)斷裂的DNA缺口，因而會(huì)引入一段，新的”遺傳信息。

最近有多項(xiàng)研究都表明，RNA介導(dǎo)的Cas9系統(tǒng)可以被用于對(duì)人類和小鼠細(xì)胞，以及細(xì)菌或

斑馬魚胚胎進(jìn)行基因組改造的工作當(dāng)中。

Cong、Mali和Cho這三個(gè)課題組開(kāi)展的多項(xiàng)研究都表明這種RNA介導(dǎo)的Cas9系統(tǒng)在人類細(xì)胞當(dāng)中同樣能夠正常的發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)化膿性鏈球菌(Streptococcuspyogenes)編碼的Cas9內(nèi)切酶進(jìn)行改造之后也可以讓它們?cè)谌祟惣?xì)胞的細(xì)胞核中被活化，然后再搭配針對(duì)人體DNA序列設(shè)計(jì)的大約20bp長(zhǎng)的雙RNA復(fù)合體或者sgRNA，就可以對(duì)人體基因組進(jìn)行定點(diǎn)切割和改造?？蒲腥藛T們?cè)诙喾N人體細(xì)胞(其中還包括了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞)內(nèi)共表達(dá)了這種專用于人體的Cas9內(nèi)切酶和向?qū)NA，結(jié)果都在預(yù)定的DNA位點(diǎn)觀察到了基因組雙鏈DNA切割，以及后續(xù)的修復(fù)現(xiàn)象，成功率高達(dá)38%,而且還發(fā)現(xiàn)這種Cas9內(nèi)切酶對(duì)細(xì)胞幾乎沒(méi)有毒性。這套Cas9系統(tǒng)還能夠在人體細(xì)胞內(nèi)以非常高的效率對(duì)普通的基因組位點(diǎn)進(jìn)行定向基因替換(targetedgenereplacement)的操作。在Jinek等人于同期發(fā)表的另外一篇論文中，他們發(fā)現(xiàn)這套R(shí)NA介導(dǎo)的Cas9系統(tǒng)還能夠在人體細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)位點(diǎn)特異性的基因組修飾動(dòng)作(site-specificgenomemodifications),而且他們還發(fā)現(xiàn)Cas9蛋白與向?qū)NA結(jié)合、組裝的動(dòng)作是這套位點(diǎn)特異性的基因組修飾過(guò)程里的限速步驟。之前的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞更傾向于使用同源重組機(jī)制對(duì)單鏈DNA損傷(single-strandedDNAbreaks)進(jìn)行修復(fù)，因此引入的突變也會(huì)更少，Mali和Cong等人也對(duì)各種不同的、只能夠形成單鏈DNA斷裂的Cas9內(nèi)切酶進(jìn)行了試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些突變的Cas9內(nèi)切酶在細(xì)胞內(nèi)引發(fā)NHEJ修復(fù)的機(jī)率的確更低，但是它們?cè)谝l(fā)基因替換(這主要是借助同源重組修復(fù)機(jī)制)的效率方面與野生型的Cas9內(nèi)切酶不相上下。Mali和Cong這兩個(gè)課題組還發(fā)現(xiàn)這套Cas9系統(tǒng)具有多重靶向功能(multiplexedtargeting)，這些Cas9內(nèi)切酶能夠與基因組中兩個(gè)不同的序列(位點(diǎn))結(jié)合，形成多處斷裂。此外，Cong等人還發(fā)現(xiàn)如果分別表達(dá)tracrRNA和crRNA，還可以進(jìn)一步提高切割的效率。這一發(fā)現(xiàn)表明，如果進(jìn)一步改進(jìn)sgRNA的設(shè)計(jì)方案，使其更接近雙RNA復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，將會(huì)進(jìn)一步提高Cas9系統(tǒng)的基因組編輯效率。除了這些細(xì)胞學(xué)的研究成果之外，科學(xué)家們還發(fā)現(xiàn)這套Cas9系統(tǒng)對(duì)于生物體同樣有效，一樣可以對(duì)生物體進(jìn)行基因組改造的操作。Jiang等人發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌內(nèi)表達(dá)多種向?qū)NA之后，Cas9內(nèi)切酶可以對(duì)細(xì)菌基因組的多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行修飾操作。借助這一技術(shù)可以對(duì)各種微生物進(jìn)行遺傳學(xué)改造，打造出符合我們?nèi)祟愋枰墓こ涛⑸?，使其造福人類，在生物能源或者生物制藥等諸多領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用潛力。Hwang等人則使用單細(xì)胞斑馬魚胚胎(one-cell-stageembryos)進(jìn)行了試驗(yàn)，他們將編碼Cas9蛋白的mRNA和特定的向?qū)NA(與斑馬魚基因組DNA的匹配機(jī)率高達(dá)24~59%)注射到斑馬魚胚胎內(nèi)，結(jié)果取得了成功，在所有被注射的斑馬魚胚胎內(nèi)，10個(gè)切割位點(diǎn)中有8個(gè)位點(diǎn)都發(fā)生了切割，并且引入了插入或者缺失突變。這一試驗(yàn)結(jié)果表明，RNA介導(dǎo)的Cas9切割活性完全可以應(yīng)用于生物體水平，哺乳動(dòng)物和植物都可以使用這種技術(shù)進(jìn)行遺傳學(xué)改造。目前最有價(jià)值的應(yīng)用應(yīng)該就是使用這種技術(shù)為各種人類疾病構(gòu)建出動(dòng)物模型。這種基因組改造技術(shù)還可以被應(yīng)用于合成生物學(xué)(syntheticbiology)、基因定向干擾或者多重基因干擾(即基因網(wǎng)絡(luò)干擾)和基因治療等領(lǐng)域。接下來(lái)的研究難點(diǎn)應(yīng)該就是如何克服脫靶效應(yīng)(off-targeteffect)，如何提高基因組改造的效率和特異性，以及如何將這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于更多的物種等方面。所以我們也需要對(duì)這種Cas9平臺(tái)與其它的基因組改造技術(shù)，比如巨核酶技術(shù)(meganucleases)、鋅指核酶技術(shù)(zinc-fingernucleases)以及TALEN(transcriptionactivator-likeeffectornuclease)技術(shù)等進(jìn)行深入和全面的對(duì)比。除了在基因組改造方面的應(yīng)用之外，使用Cas9平臺(tái)還可以進(jìn)行基因沉默等方面的