甘蔗自育品種ssr核心引物的篩選

甘蔗自育品種ssr核心引物的篩選

我國甘蔗品種的繁殖始于20世紀(jì)50年代。在“15”期間，我們種植了近200種甘蔗新品種。其中，在“5”和“15”之間，發(fā)展最快的是通過省級以上審定的50個品種。1材料和方法1.1核心引物組合效率測定27份甘蔗良種(表1)中19個品種通過國家、省級審定,8個品種進入國家或云南省甘蔗品種區(qū)試,有希望在“十一五”期間通過省級以上審定。同時選取10個中國蔗區(qū)主栽品種(不包括云南甘蔗自育品種)來檢驗核心引物組合效率。所有品種葉片組織由國家甘蔗種質(zhì)資源開遠圃(NationalNurseryofSugarcaneGermplasmResources,NNSGR)和云南省農(nóng)科院甘蔗研究所(YunnanSugarcaneResearchInstitute,YSRI)提供。1.2葉片矩陣dna提取與ssr分析參照蔡青等1.3ssr-pcr擴增多態(tài)性條帶比率及聚類區(qū)分率采用人工讀帶的方式,每對SSR引物檢測1個位點,在相同遷移位置上,有帶記為1,無帶記為0,每條帶相當(dāng)1個等位基因建立0-1矩陣。使用標(biāo)記位點的多態(tài)性條帶比率(percentageofpolymorphicbands,PPB),Jaccard(1908)遺傳相似性(geneticsimilarity,GS)、多態(tài)信息量(polymorphisminformationcontent,PIC)、品種聚類區(qū)分率(rateofdistinguishingcultivarsbycluster,RDCC)鑒別引物,其中PPB=a/(a+b),Gs1.4dna分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖的繪制根據(jù)分子量Marker的片段大小的對數(shù)值與電泳遷移距離繪制出DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,然后用直尺量出每個擴增片段在膠板上的遷移距離,依據(jù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖計算出每個片段的分子量,同時根據(jù)0-1矩陣?yán)L制膠板圖的標(biāo)準(zhǔn)化圖。2結(jié)果與分析2.1高引用效率分析選擇合適的引物是開展DNA指紋圖譜研究的關(guān)鍵因素之一2.2最佳引物組合雖然部分單對核心引物能夠完全區(qū)分所有云南甘蔗自育品種,但品種最大相似性系數(shù)達到了0.833,隨著以后自育品種數(shù)量的增多,單個引物的區(qū)分效率將會明顯下降,因此有必要使用多對引物進行鑒定。為了選出有效的引物組合,將8對引物進行兩兩組合,從表4可以看出,28個組合中26個組合可以將品種完全區(qū)分開,引物組合MSSCIR26/SMC336BS,SMC21SA/MSSCIR66品種最大相似性系數(shù)為1.000,品種聚類區(qū)分率為93%,有兩個品種無法區(qū)分,因此屬于低效的引物組合;而引物組合MSSCIR36/MSSCIR21是最有效的,品種最大相似性系數(shù)為0.773,最低,品種聚類區(qū)分率為100%;其次為MSSCIR16/MSSCIR36,第3為MSSCIR36/SMC336BS。整體來看引物MSSCIR36是比較有效的組合引物,與其他引物組合具有很好的品種區(qū)分效果,其次為MSSCIR21、SMC336BS、MSSCIR16。由于僅用兩對引物就可以將所有參試品種有效區(qū)分,故選用雙引物組合產(chǎn)生的分子數(shù)據(jù)用于云南自育品種的DNA指紋身份證構(gòu)建。2.3品種聚類關(guān)系為了增加所構(gòu)建分子指紋身份證的實用性,選取中國蔗區(qū)種植面積較大的10個主栽品種(不包括云南甘蔗自育品種)與27份云南甘蔗自育品種進行相似性和聚類分析,來檢驗排名前3的引物組合效率(表5)。評價結(jié)果表明,3個引物組合對37份品種的聚類區(qū)分率都為100%,都能有效地區(qū)分所有參試品種。從37份品種最大相似性系數(shù)來看,引物組合MSSCIR36/MSSCIR21的最大,為0.882,品種聚類關(guān)系表現(xiàn)為云蔗71-998與桂11最為相似,為0.882,其次為云蔗65-225與云蔗68-154,為0.773;引物組合MSSCIR16/MSSCIR36、MSSCIR36/SMC336的品種最大相似性系數(shù)都為0.800,從表面來看兩個引物組合效率相當(dāng),但從不同引物組合得到的品種聚類關(guān)系來看MSSCIR16/MSSCIR36的綜合區(qū)分效率最好,可作為構(gòu)建云南甘蔗自育品種分子指紋身份證的最佳引物組合,因為MSSCIR16/MSSCIR36表現(xiàn)出的品種聚類關(guān)系中以主栽品種之間最為相似,如桂17與粵糖93-159最為相似,為0.800,其次為ROC22與ROC10為0.789,第3為云蔗71-95與云蔗03-103,為0.778,與主栽品種最為相似的云南甘蔗自育品種為云蔗99-596,為0.667,所以在保證能有效區(qū)分云南甘蔗自育品種時,還能十分有效地區(qū)分云南甘蔗自育品種和主栽品種;而MSSCIR36/SMC336表現(xiàn)為云蔗8-173與桂17最為相似,為0.800,其次為云蔗65-225與云蔗68-154,為0.786,效率不如MSSCIR16×MSSCIR36。2.4納入品種的重要信息為進一步提高DNA指紋身份證的實用性和參考價值,品種DNA指紋代碼不僅包含分子數(shù)據(jù),還應(yīng)納入品種的重要信息。故選用5組代碼組成品種DNA指紋身份證,第1組為國圃號,即該品種全國唯一代碼,參見國家甘蔗種質(zhì)資源圃標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)庫;第2組為品種育成國家地區(qū),相應(yīng)編號參照《現(xiàn)代甘蔗育種的理論與實踐》附錄II品種系列名稱對照表3討論3.1選擇和評估關(guān)鍵引用物質(zhì)核心引物的篩選和確定是DNA指紋圖譜構(gòu)建的重要步驟3.2開展作物品種資源鑒定是解決作物品種使用上出現(xiàn)的矛盾的基目前,我國作物品種資源的生產(chǎn)和經(jīng)營還很不規(guī)范,品種引種混亂或品種造假的現(xiàn)象屢有發(fā)生,極大地損害了品種專利擁有者和廣大農(nóng)民的經(jīng)濟利益,因此開展作物品種資源鑒定顯得尤為重要3.3指紋數(shù)據(jù)不斷擴由于甘蔗品種數(shù)目不是固定的,每年各遺傳育種單位都會育出新的品種充實到品種庫,推廣到生產(chǎn),品種的分子指紋身份證數(shù)據(jù)也必將隨著新品種指紋數(shù)據(jù)的輸入而得到不斷擴大;同時隨著品種數(shù)據(jù)庫的不斷增大,現(xiàn)有引物組合的鑒定效率必將受到影響,因此品種分子指紋身份證數(shù)據(jù)也應(yīng)該像居民身份證一樣具有可擴充性。當(dāng)現(xiàn)有引物組合不能滿足品種鑒定需求時,可增加新的有效核心引物數(shù)據(jù)進入分子指紋數(shù)據(jù)庫,從而確保數(shù)據(jù)庫的準(zhǔn)確性、及時性和實用性。4基于ir6組合的dna指紋