油菜種質(zhì)多態(tài)性分析

油菜種質(zhì)多態(tài)性分析

目前，中國油菜業(yè)占世界總產(chǎn)值的13%以上，面積和產(chǎn)量是世界的首要任務(wù)。隨著DNA標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展和檢測技術(shù)的日趨完善,從DNA層次上對品種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定成為可能1材料和方法1.1作物研究來源收集了130份常用的甘藍(lán)型油菜材料(其中常規(guī)種或資源101份,雜交種29份),分別由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所、西北農(nóng)林科技大學(xué)、陜西省咸陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所、江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所、浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所和安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供。1.2提取和檢測dna參照Dellaporta等1.3ssr引物的篩選根據(jù)文獻(xiàn),從的Brassica數(shù)據(jù)庫中均勻選取分布于油菜19個連鎖群上的423對SSR引物,及中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所提供40對油菜特異性SSR引物,共計463對,由Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成。1.4pcr擴增系統(tǒng)和電泳檢測PCR反應(yīng)總體積為20μL,含7.14μLddH1.5擴增條帶排序記錄每種引物在供試油菜材料上擴增出的整體帶型(條帶組合),作為1個等位變異看待,將每種引物在供試材料中擴增的條帶組合按照從簡單到復(fù)雜的原則排序,依次記為1,2,3……n,對每種不同帶型都有一個對應(yīng)的數(shù)字標(biāo)識。應(yīng)用Powermarker3.252結(jié)果與分析2.1引物篩選及其擴增特征選取12份來源、類型不同的油菜材料(9603、黔油18號、南陽41、中雙10號、成油1號、寧油10號、勝利青梗、135、川農(nóng)長角、浙油18、Marnoo、Midas),對463對引物進(jìn)行初步篩選,得到76對多態(tài)性引物,多態(tài)性引物比率為16.41%;用其余118份供試材料對初篩引物進(jìn)行復(fù)篩,得到33對擴增清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性較高、片段大小適中(100~300bp)的引物(表1),33對引物在130份供試材料中共檢測到191個等位變異,每個位點的等位變異數(shù)目變幅為3~9,平均為5.7879,平均有效等位變異數(shù)為4.7307;平均多樣性指數(shù)為1.5515,變化范圍0.7738(OL10F12)~2.0451(BrGMS075);引物個體識別能力平均為0.7428,變化范圍從0.3892(OL10F12)~0.8629(BrGMS075),多態(tài)信息含量平均為0.7972,表明入選的SSR標(biāo)記引物能揭示豐富的遺傳多態(tài)性,可以作為核心引物使用。2.2種常見品種的遺傳聚類分析利用33對核心引物分析供試材料的遺傳多態(tài)性,應(yīng)用NtsysVer.2.1進(jìn)行主坐標(biāo)分析,評價所選引物對供試材料的區(qū)分能力(圖1)。從圖1中可看出,在橫、縱坐標(biāo)軸內(nèi),所有的品種均被完全區(qū)分,說明入選的33個SSR標(biāo)記引物能夠有效地區(qū)分供試材料。在2個主坐標(biāo)方向上,供試品種大致可以劃分為A、B、C3類,A類的聚合程度較高,表明類內(nèi)基因型間的親緣關(guān)系比較接近,從國外引進(jìn)的多數(shù)油菜品種都集中分布于A類[105(Ru6)、107(Start)、108(Major)、109(Primor)、111(Oro)、113(Triton)、116(Tower)、117(農(nóng)林18號)、122(Grant)、127(Falcou)、128(Gcsunder)等];B類、C類的離散程度較高,表明品種間的遺傳差異較大。參試材料中一些親本材料[4(父5)、5(18AB)、7(88-204)、8(208A)、9(1186C)、14(1521C)、18(N131)等]距離中心點位置一般較遠(yuǎn),且彼此相離,反映了雜種優(yōu)勢對親本的遺傳距離有著較高的要求。一個重要的發(fā)現(xiàn)是同一地區(qū)基因型材料間的遺傳距離往往較近,如江蘇的54(寧油10號)、55(寧油14號)、56(寧油12號)、57(寧油20號)、58(寧油18號)、59(寧雜15號)、60(寧雜11號)、65(紅油3號)等,表現(xiàn)了較高的聚類程度。陜西的69(秦優(yōu)11號)、70(秦優(yōu)10號)、72(早豐1號)、74(秦油1號)等,貴州的24(油研2號)、25(黔油18號)、26(油研10號)、27(黔油20號),湖北的34(甘油2號)、39(H166)、41(中油98D)、43(華油3號)、44(華油13號)、49(華油雜13)等,河南的28(雜雙1號)、29(南陽41)、30(豫油2號)等,上海的82(23號油菜)、83(滬激早)、84(工農(nóng)1號)等,也具有類似表現(xiàn)。這可能與育種家們對其所使用的育種材料的適應(yīng)性要求和偏好積淀有關(guān)。另一值得提及的問題是供試材料的雜種帶型表現(xiàn)十分復(fù)雜。圖2為6個雜交種和其相應(yīng)親本在3對核心引物中的擴增表現(xiàn)?？梢钥闯?雜種擴增出雙親互補帶型的情況并不普遍,大多表現(xiàn)出父(或偏父)型、母(或偏母)型或不規(guī)則混合型等多種復(fù)雜形式,這給利用核心標(biāo)記進(jìn)行親子鑒定帶來一定困難,同時也是異源多倍體遺傳復(fù)雜性的具體體現(xiàn)。2.3核心引物指紋圖譜的構(gòu)建,應(yīng)遵循唯一性和簡約性原則。唯一性是指每1個品種或基因型材料都應(yīng)具有1個與其對應(yīng)的唯一DNA(SSR)指紋,以便品種的識別和區(qū)分。在一定的概率確保下,通過對核心引物的科學(xué)選擇、系統(tǒng)組合和規(guī)范排列,便能實現(xiàn)唯一性要求。在確保唯一性的前提下,盡量使用較少引物組合,即簡約性原則,能夠大大減少工作量和不必要重復(fù),同時也有利于指紋技術(shù)的推廣和比對。根據(jù)這一原則,參考陳昌文等目前我國現(xiàn)保存的油菜基因型資源8000余份,按引物組合能夠區(qū)分最大品種數(shù)N=G2.4多帶型擴增13e06將7個核心標(biāo)記在供試的基因型材料中擴增出的所有不同帶型(即SSR指紋),進(jìn)行數(shù)字化標(biāo)識,如圖3所示,引物BrGMS075在供試的基因型材料中共擴增出6種不同的帶型,依次標(biāo)記為1、2……6,Na14E08擴增出9種不同帶型,依次標(biāo)記為1、2、3……9,其余類推。每個供試油菜基因型用7個標(biāo)記引物(次序為:BrGMS075、Na14E08、BrAS084、CB10545、Na14G10、CN57、Ra2E04)進(jìn)行擴增,將其帶型組合作為該基因型SSR指紋,再按順序?qū)蛿?shù)字標(biāo)識排列成的7位數(shù)字作為指紋代碼,即分子身份證(表4)。例如圖4所示,材料9603指紋代碼可表示為1544833,即在BrGMS075引物上的擴增帶型為1號帶型、在Na14E08引物上的擴增帶型為5號帶型、在BrAS084引物上的擴增帶型為4號帶型,以此類推,在第7個引物Ra2E04擴增出的為3號帶型。3討論和結(jié)論3.1選擇關(guān)鍵字和確定方法核心引物的篩選和確定是DNA指紋圖譜構(gòu)建的重要步驟3.2ssr引物序列的等位變異以往油菜SSR等位基因記錄方式,多采用每對SSR引物檢測1個位點,在相同遷移位置上,有帶記為“1”,無帶記為“0”,每條帶相當(dāng)1個等位基因,建立“0~1”矩陣3.3作為油松的油松本研究中的供試材料來源于不同國家和地區(qū),遺傳基礎(chǔ)豐富。從所構(gòu)建的品種分子身份證可以看出,遺傳背景差異較大的品種分子身份證相差較大,如貴州品種黔油20號和河南品種南陽41的分子身份證分別為1522623和4667745,差異極大;遺傳背景相近的品種分子身份證較為相似,如來源于江蘇的寧油20號和紅油3號的分子身份證分別為2673224和2673225,表現(xiàn)出很大的相似性,兩者的母本均為中油821。由此可見,種質(zhì)資源和品種的分子身份證可為種質(zhì)創(chuàng)新和品種選育提供參考。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展,考慮到檢測效率和可比性優(yōu)勢,可采用如熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳等技術(shù)作為分析手段,實現(xiàn)分子身份證制作的高精度及高通量。另外,品種是育種工作的產(chǎn)物,是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料,具有商品屬性。單純意義的分子身份證并不能完全表示一個品種包含的所有信息,是較為片面的。應(yīng)結(jié)合其重要的商品屬性,將品種的商品信息與指紋信息相結(jié)合,才能更加準(zhǔn)確定位描述一個品種的全部身份信息本研究利用從463對SSR引物中篩選出的33對核心引物(分布于油菜19個連鎖群上),可將供試130份甘藍(lán)型油菜材料完全區(qū)分,且多態(tài)性良好,主坐標(biāo)分析顯示材料的遺傳相似性與實際較為吻合。依據(jù)引物的多態(tài)信息含量高低先后選擇,通過對33對核心引物的逐級篩選,確立了可用于甘藍(lán)型油菜分子身份證構(gòu)建的最少7對引物組合,構(gòu)建的130份油菜材料的7位