基于ssr分子標(biāo)記構(gòu)建的平菇種質(zhì)分子身份證

基于ssr分子標(biāo)記構(gòu)建的平菇種質(zhì)分子身份證

扁平是一種具有悠久歷史和廣泛栽培范圍的食用菌。平菇原專指糙皮側(cè)耳(Pleurotusostreatus),現(xiàn)常將側(cè)耳屬幾個可以栽培的近緣種泛稱為平菇近年來,分子生物學(xué)手段因具有不受環(huán)境影響且變異豐富等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用到食用菌菌株鑒別中來1材料和方法1.1生長和抗性試驗(yàn)結(jié)果供試菌株為河北省主栽平菇品種,來源于科研單位或菌種公司。經(jīng)多年的栽培試驗(yàn)測試,17個平菇品種均表現(xiàn)為穩(wěn)定而特異的表型性狀,并且拮抗試驗(yàn)顯示17個菌株兩兩之間均有拮抗。供試菌株的品種名稱和來源見表1。1.2dna的提取將活化好的平菇菌種塊轉(zhuǎn)接至鋪有玻璃紙的PDA平板上,25℃暗光培養(yǎng)5d,刮取新鮮菌絲體100mg左右,加入液氮研磨,按照植物基因組DNA提取試劑盒(購于天根生化科技有限公司)說明,提取基因組DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測提取的DNA濃度和純度。將DNA濃度稀釋至20ng·μL1.3co1的擴(kuò)展和分析參考黃晨陽1.4全基因組序列從JGI數(shù)據(jù)庫中搜索并下載PleurotusostreatusPC15v2.0全基因組序列(/PleosPC15_2/PleosPC15_2.download.html)。利用SSRLocator軟件對其全基因組序列進(jìn)行單至六核苷酸重復(fù)SSR序列的查找1.5ssr引物篩選選取4個平菇菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行SSR引物初篩。SSR-PCR反應(yīng)體系:總體積20μL,包括10×PCRbuffer2μL,25mmol·L1.6菌株相似度分析根據(jù)4個菌株擴(kuò)增結(jié)果篩選出擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性豐富且區(qū)分度高的SSR引物。分別對17個供試菌株進(jìn)行擴(kuò)增試驗(yàn)。根據(jù)供試菌株的擴(kuò)增圖譜,參考每個引物擴(kuò)增目的片段的分子量大小,將強(qiáng)帶或可分辨/重復(fù)性好的弱帶記為有效的等位基因譜帶,重復(fù)性不好的弱帶不考慮,由小到大依次統(tǒng)計(jì)等位基因譜帶,分析每對引物對17個菌株擴(kuò)增產(chǎn)生的帶型,并對不同帶型進(jìn)行賦值編碼,標(biāo)記為1~9。為了保證每位編碼只有1位數(shù)字,第10種帶型標(biāo)記為0,將菌株帶型轉(zhuǎn)成零一矩陣,采用NTSYS-2.10e軟件計(jì)算同一物種菌株間相似度。根據(jù)菌株間相似度分析結(jié)果,如果存在相似度為100%的菌株,則需設(shè)計(jì)新的SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增,直至17個菌株的相似度小于100%,即將17個菌株全部區(qū)分開。根據(jù)帶型編碼構(gòu)建17個平菇品種的SSR分子標(biāo)記身份證。2結(jié)果與分析2.1opiae檢測結(jié)果CO1擴(kuò)增結(jié)果見圖1。17個菌株均能擴(kuò)增得到單一條帶,根據(jù)條帶大小,供試菌株分為3組。第2號、第9號、第12號和第16號菌株為P.ostreatus,共4株;第3號、第4號、第6號、第8號、第10號、第11號、第14號和第15號菌株為P.cornucopiae,共8株;第1號、第5號、第7號、第13號、第17號菌株為P.pulmonarius,共5株。2.2ssr擴(kuò)增多態(tài)性分析根據(jù)4個菌株對48對SSR引物的篩選結(jié)果,經(jīng)過多次擴(kuò)增試驗(yàn)驗(yàn)證,最終選取9對擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性豐富且區(qū)分度高的SSR分子標(biāo)記,見表2。這九對SSR分子標(biāo)記所對應(yīng)的SSR位點(diǎn)分別分布在PleurotusostreatusPC15v2.0全基因組12條scaffold的第3條~第8條上。9對SSR標(biāo)記在17個平菇菌株中共檢測到52個等位基因。不同SSR標(biāo)記檢測到等位基因數(shù)目范圍為3個~8個,平均檢測效率為5.8個/標(biāo)記,擴(kuò)增的等位基因譜帶片段大小見表3。各位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(PIC=1-∑Pi進(jìn)一步根據(jù)9對引物對17個菌株擴(kuò)增的分子指紋圖譜,將帶型轉(zhuǎn)成零一矩陣,計(jì)算同一物種內(nèi)菌株間的相似度。4株P(guān).ostreatus菌株間的遺傳相似性系數(shù)為0.44~0.89,8株P(guān).cornucopiae菌株間的遺傳相似性系數(shù)為0.48~0.85,5株P(guān).pulmonarius菌株間的遺傳相似性系數(shù)為0.33~0.93,說明這九對SSR引物可以將17個平菇品種完全區(qū)分開。2.3分子身份證構(gòu)建9對引物在17個菌株中共產(chǎn)生53種帶型,其中在P.ostreatus組中檢測到18種、P.cornucopiae組27種、P.pulmonarius組27種,不同物種的菌株間可以產(chǎn)生相同的帶型。9個引物分別擴(kuò)增的帶型數(shù)為4種~10種。引物P25擴(kuò)增的帶型數(shù)最多為10種。圖2為引物P4對17個菌株擴(kuò)增產(chǎn)生的全部帶型和賦值情況,共有6種帶型。每對引物產(chǎn)生的不同標(biāo)準(zhǔn)帶型和賦值情況見表3、表4。對17個供試菌株的分子身份證進(jìn)行編碼,每個菌株的分子身份證分別由9個字符串組成,從左到右依次代表引物P3、P4、P12、P14、P22、P23、P25、P26、P34產(chǎn)生的第幾種帶型,結(jié)果見表5。從表5可以看出,17個平菇品種分別具有特異的分子身份證編碼。3討論3.1ssr引物篩選對于SSR分子身份證的構(gòu)建方法,不同的研究者有不同的編碼原則。于瀟等本研究選取9對SSR引物對17個菌株擴(kuò)增結(jié)果顯示,大部分菌株都是雜合帶型,即包括兩個以上的等位基因,這可能是由于平菇栽培過程中容易產(chǎn)生孢子而發(fā)生自然雜交3.2在平行研究中，ssr分子標(biāo)記的應(yīng)用SSR分子標(biāo)記多用于平菇種質(zhì)資源遺傳多樣性分析及菌株鑒定等研究3.3側(cè)耳屬物種p.cornucopiae在我國,不同地區(qū)稱謂的平菇所指