熒光蛋白-(整理)

熒光定義熒光（fluorescence）又作“螢光”，是指一種光致發(fā)光的冷發(fā)光現(xiàn)象。當(dāng)某種常溫物質(zhì)經(jīng)某種波長(zhǎng)的入射光（通常是紫外線或X射線）照射，吸收光能后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，并且立即退激發(fā)并發(fā)出比入射光的的波長(zhǎng)長(zhǎng)的出射光（通常波長(zhǎng)在可見光波段）；而且一旦停止入射光，發(fā)光現(xiàn)象也隨之立即消失。具有這種性質(zhì)的出射光就被稱之為熒光。原理光照射到某些原子時(shí)，光的能量使原子核周圍的一些電子由原來(lái)的軌道躍遷到了能量更高的軌道，即從基態(tài)躍遷到第一激發(fā)單線態(tài)或第二激發(fā)單線態(tài)等。第一激發(fā)單線態(tài)或第二激發(fā)單線態(tài)等是不穩(wěn)定的，所以會(huì)恢復(fù)基態(tài)，當(dāng)電子由第一激發(fā)單線態(tài)恢復(fù)到基態(tài)時(shí)，能量會(huì)以光的形式釋放，所以產(chǎn)生熒光。熒光是物質(zhì)吸收光照或者其他電磁輻射后發(fā)出的光。大多數(shù)情況下，發(fā)光波長(zhǎng)比吸收波長(zhǎng)較長(zhǎng)，能量更低。但是，當(dāng)吸收強(qiáng)度較大時(shí)，可能發(fā)生雙光子吸收現(xiàn)象，導(dǎo)致輻射波長(zhǎng)短于吸收波長(zhǎng)的情況發(fā)射。當(dāng)輻射波長(zhǎng)與吸收波長(zhǎng)相等時(shí)，既是共振熒光。熒光強(qiáng)度：熒光強(qiáng)度與該種物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率、消光系數(shù)以及含量等因素有關(guān)。熒光量子產(chǎn)率Q：量子產(chǎn)率表示物質(zhì)將吸收的光能轉(zhuǎn)化為熒光的本領(lǐng)，是熒光物質(zhì)發(fā)出光子數(shù)與吸收光子數(shù)的比值。熒光蛋白分子的亮度由其量子產(chǎn)率與消光系數(shù)的乘積決定，與成像檢測(cè)靈敏度密切相關(guān)。熒光蛋白綠色熒光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP）在光譜的綠光區(qū)（500nm-525nm）已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種熒光蛋白，而且來(lái)源廣泛，包括不同種屬的Aequorea、橈足類動(dòng)物、文昌魚以及珊瑚。然而多數(shù)有齊聚反應(yīng)，即使最好的熒光蛋白與EGFP相比，也沒有明顯的優(yōu)點(diǎn)?；蛟S目前活細(xì)胞成像最好的選擇是GFP衍生的Emerald（祖母綠），它與EGFP的特性相似。Emerald包含F(xiàn)64L和S65T突變，另外還有四個(gè)點(diǎn)突變從而改進(jìn)了折疊、37℃時(shí)的突變率以及亮度。雖然Emerald比EGFP更有效，但含有快速光漂白成分，可能在某些環(huán)境下其定量成像會(huì)受到影響。下面主要介紹GFP及其衍生型熒光蛋白：（1）來(lái)源綠色熒光蛋白最早由美籍日裔科學(xué)家下村修于1962年在水母中發(fā)現(xiàn)。這種蛋白質(zhì)在藍(lán)色波長(zhǎng)范圍的光照激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，其發(fā)光過程需要冷光蛋白質(zhì)Aequorin的幫助，而且，這個(gè)冷光蛋白質(zhì)可與鈣離子（Ca2+）相互作用。在水母中發(fā)現(xiàn)的野生型綠色熒光蛋白的分子量較小，僅為27~30kDa，而編碼GFP的基因序列也很短，為2.6kb。（2）性質(zhì)GFP由238個(gè)氨基酸殘基組成。GFP序列中的65-67位殘基（Ser65-Tyr66-Gly67）可自發(fā)形成熒光發(fā)色基團(tuán)——對(duì)羥基苯咪唑啉酮GFP的激發(fā)光譜在400nm附近有一個(gè)主激發(fā)峰，在470nm附近有一個(gè)次激發(fā)峰。發(fā)射光譜在505nm附近有一尖銳的主發(fā)射峰，在540nm附近有一肩峰GFP的化學(xué)性質(zhì)相當(dāng)穩(wěn)定，無(wú)光漂白現(xiàn)象（Photobleaching），用甲醛固定和石蠟包埋亦不影響其熒光性質(zhì)。在細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域中，綠色熒光蛋白基因常被用作報(bào)告基因。（3）野生型野生型GFP（wildtypeGFP,wtGFP）從一開始就引起了人們極大的興趣，而且被用作新型的簡(jiǎn)單報(bào)告基因及體內(nèi)標(biāo)記，但GFP在異源生物體中的表達(dá)并非那么簡(jiǎn)單。例如，研究人員很早就發(fā)現(xiàn)需要在較高的溫度下孵育才能在細(xì)胞或生物體中表達(dá)GFP，并且wtGFP在37℃的熱穩(wěn)定性差。這些都阻礙了它在轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用。這些難題促使人們進(jìn)一步篩選分離wtGFP的變體。現(xiàn)在，人們已經(jīng)找到了熒光強(qiáng)度更強(qiáng)且更耐熱的變體。這些變體多數(shù)為經(jīng)突變的脫輔基蛋白，它們可防止高溫導(dǎo)致的錯(cuò)誤折疊。近年來(lái)出現(xiàn)的新型wtGFP基因突變體的激發(fā)和發(fā)射譜發(fā)生了改變，熱穩(wěn)定性和熒光強(qiáng)度得到了提高，GFP報(bào)告基因在小鼠中的應(yīng)用就是以這些變體作為基礎(chǔ)的。（4）增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）現(xiàn)在，應(yīng)用最為廣泛的是紅移變體增強(qiáng)型GFP（EGFP）。諸如EGFP這些紅移變體的最大激發(fā)峰發(fā)生紅向移動(dòng)，大約為490nm，這一波長(zhǎng)也恰好是多數(shù)分光設(shè)備、流式細(xì)胞儀及共聚焦顯微鏡的常用波長(zhǎng)。EGFP有兩個(gè)氨基酸突變，當(dāng)被藍(lán)光激發(fā)時(shí)，它發(fā)出的熒光要比wtGFP亮30-40倍。wtGFP和包括EGFP在內(nèi)的多數(shù)變體半衰期長(zhǎng)，所以不適合精確追蹤表達(dá)的減少或損耗。（5）不穩(wěn)定增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（dEGFP）為克服這一問題，人們?cè)?998年構(gòu)建了不穩(wěn)定增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（dEGFP）。原理就是將EGFP的cDNA融合到小鼠鳥氨酸脫羧酶（Ornithinedecarboxylase,ODC）基因的C-末端。ODC含有一個(gè)PEST序列，這個(gè)序列可促進(jìn)該蛋白在細(xì)胞內(nèi)四、熒光素和熒光素酶1、螢火蟲熒光素酶目前常用的螢火蟲熒光素酶來(lái)源于北美螢火蟲(Photinuspyralis)，是一個(gè)61kDa的單體酶，無(wú)需表達(dá)后修飾，直接具有完全酶活，反應(yīng)需要底物熒光素以及ATP、O2、Mg2+等的參與。海腎熒光素酶海腎熒光素酶來(lái)源于海腎（Renillareniformis），是一個(gè)36kDa的單體酶，表達(dá)后無(wú)需修飾，即可具有完全酶活。反應(yīng)只需要腔腸素（Coelenterazine）和O2參與。Gussia熒光素酶Gussia