37和73磷灰石雙相骨修復(fù)材料的ames試驗(yàn)研究

37和73磷灰石雙相骨修復(fù)材料的ames試驗(yàn)研究

骨修復(fù)材料是一種新型生物材料，是目前生物材料研究的熱點(diǎn)。骨修復(fù)材料分為醫(yī)用金屬材料、醫(yī)用生物陶瓷、醫(yī)用高分子材料和醫(yī)用復(fù)合材料,可廣泛用于人工骨、人工關(guān)節(jié)、人工齒根、骨結(jié)合材料等許多方面。研究開(kāi)發(fā)新型骨修復(fù)材料以滿(mǎn)足醫(yī)學(xué)科學(xué)發(fā)展和臨床需求逐步成為研究重點(diǎn)磷酸三鈣(TricalciumPhosphate,TCP)和羥基磷灰石(hydroxyapatite,HA)都是最常使用的骨修復(fù)材料,均為生物活性陶瓷。磷酸三鈣的分子式為Ca雙相骨修復(fù)材料在臨床應(yīng)用前首先要依據(jù)GB/T16886系列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行生物安全性評(píng)價(jià),其中的遺傳毒性評(píng)價(jià)不可或缺。一直以來(lái),學(xué)者們都會(huì)使用鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)(Ames試驗(yàn))對(duì)材料的致突變性進(jìn)行初步研究,如納米羥基磷灰石人工骨,納米磷酸三鈣復(fù)合人工骨、聚-羥基丁酸酯材料等本研究采用生理鹽水和二甲基亞砜?jī)煞N浸提介質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn),通過(guò)Ames試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)-TCP/HA雙相骨修復(fù)材料的致突變性,對(duì)體外遺傳毒性的潛在風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估,為醫(yī)療器械產(chǎn)品的選材和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供毒理學(xué)數(shù)據(jù),為人體使用的安全性奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1試驗(yàn)材料和提取物的制備1.1.1雙相材料相型材料試驗(yàn)選用磷酸三鈣/羥基磷灰石(-TCP/HA)雙相材料,-TCP與HA比例分別約為3∶7和7∶3。材料為白色粉末,潔晶度≥50%,粒徑在0.3~0.5mm;其Ca/P原子比1.5±0.5。1.1.2浸提介質(zhì)成分配介質(zhì)采用0.9%氯化鈉溶液(SC)和二甲基亞砜(DMSO)兩種溶劑作為浸提介質(zhì)。按0.2g/ml的浸提比例,分別加入SC和DMSO進(jìn)行浸提,(50±2)℃放置72小時(shí),備用。1.1.3敵克松sc/sco陰性對(duì)照:取上述同批號(hào)SC和DMSO,置相同條件下浸提72小時(shí)。陽(yáng)性對(duì)照:非活化試驗(yàn)(-S9),使用0.5mg/mL敵克松(Dexon),用SC配制;活化試驗(yàn)(+S9),菌株TA97、TA98、TA100使用2mg/mL的2-氨基芴(2-AF),菌株TA102使用0.5mg/mL的1,8-二羥基蒽醌,均用DMSO配制。1.2菌株鑒定情況采用鼠傷寒沙門(mén)氏菌組氨酸缺陷型突變株TA97、TA98、TA100和TA102四株菌,均經(jīng)組氨酸缺陷型鑒定、脂多糖屏障缺陷鑒定、R因子鑒定、uvrB修復(fù)缺陷型鑒定、四環(huán)素抗性鑒定和自發(fā)回變率鑒定合格。1.3生化活性試驗(yàn)制備添加了VB液和葡萄糖溶液的瓊脂培養(yǎng)基平板,備用。頂層培養(yǎng)基分裝成2mL/管,滅菌后備用。采用由大鼠肝制備的S9混合液提供代謝活化環(huán)境。非活化試驗(yàn)中,在保溫的頂層培養(yǎng)基中依次加入0.2mol/L磷酸鹽緩沖液0.5mL、樣品浸提液0.1mL和新鮮菌液0.1mL,混勻后傾入底層培養(yǎng)基上,陰性對(duì)照組加入0.1mLSC,陽(yáng)性對(duì)照加入0.1mLDexon。活化試驗(yàn)中,加入5%的S9混合液替代磷酸鹽緩沖液同法試驗(yàn),陽(yáng)性對(duì)照加入0.1mL2-AF或1,8二羥基蒽醌。每組均設(shè)3個(gè)平行皿。方法詳見(jiàn)文獻(xiàn)2結(jié)果2.1回復(fù)突變菌落數(shù)ue0afs的測(cè)定計(jì)數(shù)并記錄每一平皿的回變菌落數(shù),計(jì)算出3個(gè)平行皿的平均值,以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)表示。陰性對(duì)照組回復(fù)突變菌落數(shù)應(yīng)在預(yù)期的范圍內(nèi),陽(yáng)性對(duì)照組回變菌落數(shù)應(yīng)至少為預(yù)期范圍的3倍。在背景菌生長(zhǎng)良好的條件下,檢測(cè)樣品浸提液各濃度組變異頻率比陰性對(duì)照至少增加2倍,即為陽(yáng)性反應(yīng)2.2sc浸提液組平板培養(yǎng)48~72小時(shí)后,S9混合液檢菌平皿無(wú)菌落生長(zhǎng);以SC為浸提介質(zhì)對(duì)-TCP/HA為3∶7和7∶3的雙相材料進(jìn)行浸提,TA97、TA98、TA100及TA102菌株回復(fù)突變的計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。2.3獨(dú)立dmso提取物組以DMSO為浸提介質(zhì)對(duì)兩種雙相材料進(jìn)行浸提,TA97、TA98、TA100及TA102菌株回復(fù)突變的計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表2。2.4樣品的致突變性試驗(yàn)表3列出了各菌株回復(fù)突變菌落的致突變比值結(jié)果,依據(jù)試驗(yàn)菌株的致突變比值(致突變比值MR=實(shí)驗(yàn)組回變菌落數(shù)/陰性對(duì)照組回變菌落數(shù))判斷樣品是否具有致突變性。結(jié)果顯示,在該試驗(yàn)條件下,陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組結(jié)果均有效,試驗(yàn)成立。無(wú)論以SC浸提還是以DMSO浸提,活化和非活化條件下,兩種不同比例的樣品浸提液對(duì)TA97、TA98、TA100和TA102菌株的回變菌落數(shù)均未大于陰性對(duì)照組2倍(即MR<2)。3遺傳毒性評(píng)價(jià)理想的骨修復(fù)材料要有良好的生物相容性、良好的生物降解性、具有三維立體多孔結(jié)構(gòu)、具有一定機(jī)械強(qiáng)度和骨引導(dǎo)性等研究發(fā)現(xiàn),材料的體內(nèi)降解是一種緩慢而復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程,其降解過(guò)程和成骨過(guò)程同步進(jìn)行,表現(xiàn)為一種“同步取代”的形式,HA和TCP植入體內(nèi)后逐漸降解并被體液緩慢的吸收,為新骨的生成提供了豐富的Ca和P,在體內(nèi)可通過(guò)新陳代謝途徑,促進(jìn)新骨組織生成。HA的降解性能差,TCP的降解性能優(yōu)于HA,但過(guò)快的降解速度不利于體內(nèi)生物組織在材料上的附著,從而不利于誘導(dǎo)成骨。TCP/HA雙相材料的降解速度介于HA和TCP之間,有望通過(guò)調(diào)節(jié)HA和TCP的比例來(lái)解決體內(nèi)的降解速度與骨組織生長(zhǎng)速度的匹配問(wèn)題-TCP/HA雙相骨修復(fù)材料作為植入類(lèi)材料需要進(jìn)行遺傳毒性評(píng)價(jià),依據(jù)ISO10993的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行(我國(guó)將其轉(zhuǎn)譯為GB/T16886系列標(biāo)準(zhǔn))。GB/T16886.3-2008中明確提出進(jìn)行醫(yī)療器械的遺傳毒性評(píng)價(jià)時(shí)應(yīng)采用體外試驗(yàn),并給出了兩種不同的試驗(yàn)方案,其中都需進(jìn)行Ames試驗(yàn),用以對(duì)材料潛在的致突變性進(jìn)行初步檢驗(yàn)。本文采用TA97、TA98、TA100和TA102標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)-TCP/HA雙相骨修復(fù)材料進(jìn)行了Ames試驗(yàn),結(jié)果顯示,兩種比例的雙相材料在有/無(wú)S9活化的條件下,使用0.9%氯化鈉溶液和DMSO兩種浸提介質(zhì),浸提液的細(xì)菌回變菌落數(shù)均未超過(guò)相應(yīng)菌株陰