克氏原螯蝦源對蝦白斑綜合征病毒的初步鑒定

克氏原螯蝦源對蝦白斑綜合征病毒的初步鑒定

近年來，克氏家族的原蝦(。白斑綜合征病毒(WSSV)為一種無包涵體病毒,地理分布廣,流行范圍大,傳染性強(qiáng),對發(fā)病蝦致死時間短,目前尚無有效的治療藥物,還不能有效地控制疫情11.1病例對照加冰保存患病克氏原螯蝦樣品采自江蘇省揚(yáng)州邵伯湖、淮安白馬湖、盱眙、南京祿口等地的養(yǎng)殖場(分別記為A、B、C、D),各取典型患病樣品20～50只,平均體重30g,所有樣品均用保溫箱加冰保存。在取樣過程中,測量和記錄養(yǎng)殖池水的常規(guī)水質(zhì)指標(biāo),了解克氏原螯蝦的養(yǎng)殖過程、養(yǎng)殖管理,觀察和總結(jié)發(fā)病特征及流行情況(表1)。1.2提取溶劑、沖洗液、內(nèi)纖維膜分別取患病克氏原螯蝦鰓少許,切成0.5mm×0.5mm×0.5mm大小的組織塊,置于4%戊二醛溶液中固定;固定后的樣品經(jīng)PBS沖洗3次,1%鋨酸固定2h;PBS沖洗3次,丙酮系列脫水;Epon′s812樹脂包埋,37℃過夜,60℃12h以上。超薄切片厚度為50～100nm,切片經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色之后在H-600型透射電子顯微鏡觀察并拍照。1.3wssv在克氏原螯蝦體內(nèi)的感染特性在組織病理切片中觀察到類似WSSV病毒顆粒后,設(shè)計出WSSV特異性引物,進(jìn)行PCR驗證。為了解病毒在克氏原螯蝦體內(nèi)不同組織間的侵染特性,筆者還分別對患病蝦的鰓、心肌、腸道、神經(jīng)、肌肉等組織進(jìn)行了WSSV的檢測。此外還檢測了另兩種常見對蝦病毒:桃拉病毒(TSV)、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV),檢測方法參照文獻(xiàn)1.3.1st引物的設(shè)計根據(jù)GenBank中WSSV序列(AF369029),利用Dnastar引物設(shè)計軟件設(shè)計1對特異性引物,引物序列為:C4:5′-TCACAGGCGTATTGTCTCTCCT-3′;N4:5′-CACGAGTCTACCGTCACAACATC-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物為300bp。1.3.2消化液ld50在冰上分別取病蝦肌肉、神經(jīng)、鰓、肝臟等組織少許于離心管中,加1.2mL消化液(100mmol·L1.3.3PCR總反應(yīng)體積設(shè)為25μL,其中含去離子水14.85μL,STR10×Buffer(Mg1.41.4.1感染實驗結(jié)果人工感染用的健康克氏原螯蝦采自江蘇省某無公害養(yǎng)殖基地,平均體重30g,采回后置于水族箱(1096cm×470cm×670cm)中暫養(yǎng)7d,發(fā)現(xiàn)無異常后開始感染實驗。1.4.2加吾ppb緩沖液分離病蝦的肝胰腺、鰓、肌肉、心臟等,加少許PPB緩沖液(376mmol·L1.4.3樣品的制備暫養(yǎng)后的克氏原螯蝦隨機(jī)分為3組,每組20只,其中第1、2組分別于第1、2腹節(jié)肌肉注射0.1mL的病毒液,第3組為對照組,注射等體積的PPB緩沖液作為對照。實驗期間水溫保持在27～29℃,每天換水50%,充氣培養(yǎng)。人工感染后,記錄克氏原螯蝦的體表變化,運(yùn)動、攝食及死亡情況,連續(xù)觀察10d。1.5wssv檢測利用建立的特異性引物PCR方法,對采集自邵伯湖、白馬湖、盱眙、祿口等地100余只克氏原螯蝦樣品進(jìn)行WSSV檢測。22.1螯下肢無定形初期無明顯癥狀,后期不攝食,反應(yīng)遲鈍,應(yīng)激能力較弱;螯肢及附肢無力,無法支撐身體;血淋巴不易凝固,頭胸甲易剝離,肝胰腺顏色淡黃,腹節(jié)肌肉蒼白;在頭胸甲部位常出現(xiàn)白斑。死亡率約為30%～50%。2.2肝胰腺組織病理學(xué)觀察在對患病克氏原螯蝦進(jìn)行透射電子顯微鏡觀察時發(fā)現(xiàn)其鰓上皮細(xì)胞有較明顯病變,細(xì)胞核肥大,病毒顆粒充脹著細(xì)胞核(圖1)。2.32.3.1wssv和ihhnv感染的比較對邵伯湖、白馬湖、盱眙、祿口等地患病克氏原螯蝦的WSSV檢測結(jié)果均呈明顯的陽性,電泳條帶明亮,感染程度較高;而TSV和IHHNV檢測均呈陰性;健康克氏原螯蝦則沒有條帶出現(xiàn)(圖2)。2.3.2wssv感染檢測結(jié)果顯示,患病克氏原螯蝦的鰓、肝臟、心肌、神經(jīng)、前腸、中腸、后腸、肌肉等組織同時受到了WSSV感染,提示在患病后期病毒顆粒已擴(kuò)散至蝦體全身(圖3)。2.4克氏原螯蝦感染后死亡情況感染克氏原螯蝦于第2天開始出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍,靜臥不動,螯肢及附肢無力,肝胰腺顏色淡黃等癥狀,在第3～9天出現(xiàn)死亡現(xiàn)象,感染后3～6天為死亡高峰期,癥狀與自然發(fā)病克氏原螯蝦相同,實驗組死亡率分別為95%和100%;對照組全部存活,無異常癥狀。在人工感染發(fā)病的克氏原螯蝦病理切片中再次觀察到WSSV病毒顆粒,PCR檢測呈陽性,證實WSSV即為導(dǎo)致此次養(yǎng)殖克氏原螯蝦暴發(fā)死亡的病源。2.5tsv和ihhnv感染情況從邵伯湖、白馬湖、盱眙、祿口等地采集了3批次共計140余只樣品,WSSV檢出率30%～52%,所有樣品中沒有發(fā)現(xiàn)TSV和IHHNV感染(表2)。3人工感染實驗對蝦白斑綜合征病毒是一種嚴(yán)重危害當(dāng)前對蝦養(yǎng)殖業(yè)的對蝦病毒,主要引起對蝦甲殼內(nèi)側(cè)白斑病變,并導(dǎo)致大批死亡目前克氏原螯蝦等甲殼動物病毒病的診斷手段主要包括病理學(xué)方法、生物學(xué)方法、免疫學(xué)方法、分子雜交方法及PCR方法等此外,在進(jìn)行人工感染實驗時發(fā)現(xiàn),制備的WSSV病毒液置于4℃冰箱中過夜后依然有致病性,而置于常溫(29～31℃)下,5～6h即喪失活性。這表明在自然環(huán)境中WSSV抗逆能力并不強(qiáng),當(dāng)環(huán)境溫度稍高時,病毒粒子即易失去感染活性,提示W(wǎng)SSV在克氏原螯蝦養(yǎng)殖塘或自然水域中可能不以離體傳播為主要方式,病毒更可能以存在于組織內(nèi)的形式,通過生物間的