轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展

轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)及其進展轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第1頁轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測普通策略和流程蛋白檢測技術(shù)核酸檢測技術(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測新技術(shù)和趨勢轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)及其進展轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第2頁一、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測普通策略和流程轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第3頁怎樣進行轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測？染色體水平轉(zhuǎn)錄組水平蛋白組水平代謝組水平GM——Non-GM？轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第4頁怎樣進行轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測？染色體水平轉(zhuǎn)錄組水平蛋白組水平代謝組水平DNA檢測RNA檢測蛋白質(zhì)檢測特征代謝物檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第5頁怎樣進行轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測？轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第6頁轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測普通流程轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第7頁二、蛋白質(zhì)檢測技術(shù)ELISA側(cè)向流動試紙條轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第8頁基于蛋白轉(zhuǎn)基因檢測方法1.酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要試劑：（1）固相抗原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2）酶標(biāo)識抗原或抗體，稱為"結(jié)合物"（conjugate）；（3）酶反應(yīng)底物。最常見檢測方法是夾心法轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第9頁基于蛋白轉(zhuǎn)基因檢測方法基本原理轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第10頁基于蛋白轉(zhuǎn)基因檢測方法加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA板孔底部，防止加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。加樣溫育洗滌顯色抗原抗體完成反應(yīng)保溫過程，應(yīng)注意溫育溫度和時間應(yīng)按要求力爭準(zhǔn)確。去除殘留在板孔中游離物質(zhì)，以及非特異性地吸附干擾物質(zhì)。洗滌是最主要關(guān)鍵技術(shù)。顯色是酶催化無色底物生成有色產(chǎn)物溫育反應(yīng)。反應(yīng)溫度和時間仍是影響顯色原因。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第11頁定量測定基于蛋白轉(zhuǎn)基因檢測方法ELSIA操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)原因較多，尤其是固相載體包被難到達各個體之間一致，所以在定量測定中，每批測試均須用一系列不一樣濃度參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定大分子量物質(zhì)夾心法ELISA，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍普通較寬，曲線最高點吸光度可靠近2.0，繪制時慣用半對數(shù)紙，以檢測物濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，將各濃度值逐點連接，所得曲線普通呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線部分是最理想檢測區(qū)域。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第12頁依據(jù)轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線依據(jù)外源蛋白標(biāo)準(zhǔn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線××××轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第13頁96微孔板用于RR大豆和Bt玉米ELISA檢測基于蛋白轉(zhuǎn)基因檢測方法Agdia轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品內(nèi)毒素蛋白檢測試劑盒轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第14頁基于蛋白轉(zhuǎn)基因檢測方法2.側(cè)向流動型免疫試紙條方法（LateralFlowstrips）

依據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合原理工作。硝化纖維代替聚苯乙烯反應(yīng)板為固相載體。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第15頁LateralFlowStripProtocolTestsforCryI(Ab)&CP4EPSPSPlant&seedsMorecomingsoon123PunchleafdiscAddbufferandgrindintubeInsertflowstripsfortesting基于蛋白轉(zhuǎn)基因檢測方法轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第16頁基于蛋白轉(zhuǎn)基因檢測方法轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第17頁CanolaCottonSoybean-+-+-+LateralFlowStrip檢測應(yīng)用基于蛋白轉(zhuǎn)基因檢測方法轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第18頁當(dāng)前應(yīng)用方法比較基于蛋白轉(zhuǎn)基因檢測方法轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第19頁三、核酸檢測技術(shù)核酸純化定性PCR技術(shù)實時熒光定量PCR技術(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第20頁基于核酸轉(zhuǎn)基因檢測方法35SpromoterEPSPSCP4NOSterminatorCaMVAgrobacteriumtumefaciensDiagramrepresentativeofaRoundupReady?sequence檢測主要依據(jù)是目標(biāo)DNA鏈與特定生物大分子結(jié)合或者與特異序列雜交目標(biāo)DNA主要由含有特定功效基因及其對應(yīng)調(diào)控元件組成。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第21頁基于核酸轉(zhuǎn)基因檢測方法開啟子基因內(nèi)含子終止子篩選檢測基因特異性檢測構(gòu)建特異性檢測轉(zhuǎn)化體特異性檢測低植物基因組高ArneHAetal.,EuroFoodResTech,核酸檢測方法策略示意圖-依據(jù)特異性高低植物基因組轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第22頁M00.10.52nt100C+%GMOcontent500400300200100basepairs(bp)180bpDNAExtractionAmplificationElectrophoresisResultSample基于核酸轉(zhuǎn)基因檢測方法檢測一般流程轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第23頁GMOidentificationNegativePositiveAuthorised?NoYesillegalAssayindividualingredientsLessthan0.9%NoneedforlabellingLabellingrequiredMorethan0.9%GMO

quantificationGMOdetectionGMOtest0.5%toleranceLot基于核酸轉(zhuǎn)基因檢測方法轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第24頁核酸提取和純化主要包含裂解和純化兩大步驟。裂解是使樣品中核酸游離在裂解體系中過程，純化則是使核酸與裂解體系中其它成份，如蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)徹底分離過程。1、基本標(biāo)準(zhǔn)分離純化核酸總標(biāo)準(zhǔn)——應(yīng)確保核酸一級結(jié)構(gòu)完整性；——排除其它分子對于提取和純化DNA污染。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第25頁核酸純化三點要求核酸樣品中不存在對酶有抑制作用有機溶劑和過高濃度金屬離子；排除其它核酸分子污染，如提取DNA分子時應(yīng)去除RNA，反之亦然。其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子污染應(yīng)降到最低程度；轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第26頁核酸制備步驟多聚糖、酚復(fù)合物、蛋白質(zhì)和其它細胞溶解物破碎細胞或包膜－核酸游離在裂解體系中沉淀核酸以去除鹽、有機溶劑等雜質(zhì)，最終得到純化核酸。裂解抽提沉淀轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第27頁

機械破壞(如：碾磨、超聲波處理、低滲裂解)化學(xué)處理法(如：去污劑裂解、離液劑處理、硫醇還原等）酶消化（溶菌酶、纖維素酶等）裂解轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第28頁核酸與蛋白質(zhì)結(jié)協(xié)力主要是正負靜電吸力、氫鍵和非極性范德華力。分離核酸最困難是將與核酸緊密結(jié)合蛋白質(zhì)分開，同時防止核酸降解。通常使用苯酚和氯仿混合物慣用來除去多聚糖、酚復(fù)合物、蛋白質(zhì)和其它細胞溶解物。酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白效果，并對核酸酶有抑制作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液時，需要振搖，為預(yù)防起泡和促使水相與有機相分離，再加上一定量異戊醇（酚：氯：異戊醉=25：24：1）。最終用氯仿抽提是為了去除核酸溶液中痕量酚。抽提轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第29頁沉淀慣用醇來沉淀核酸以去除鹽、有機溶劑等雜質(zhì)。核酸是多聚陰離子水溶液化合物，慣用有機溶劑有乙醇、異丙醇、聚乙二醇等。乙醇優(yōu)點：對鹽類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易揮發(fā)除去，不影響以后試驗。缺點：需要量大，普通要求低溫操作異丙醇優(yōu)點：需體積小，速度快，適于濃度低、體積大DNA樣品沉淀。普通不需低溫長時間放置。缺點：異丙醇沉淀核酸比較緊湊，易使鹽類、蔗糖與DNA共沉淀．異丙醇難以揮發(fā)除去。所以，最終用70％乙醇漂洗數(shù)次。聚乙二醇優(yōu)點：可用不一樣濃度PEG選擇沉淀不一樣相對分子質(zhì)量DNA片段。應(yīng)用6000相對分子質(zhì)量PEG進行DNA沉淀時，使用濃度與DNA片段大小成反比。注意：PEG沉淀普通需加0.5mol/LNaCl或10mmol/LMgCl2。要除去DNA沉淀中PEG。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第30頁CompanyLogoDNA提取方法DNA提取方法BECDACTAB法SDS法聚乙烯吡咯烷酮法其它親和誘捕核酸純化方法轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第31頁核酸質(zhì)量評定與定量熒光定量測定法紫外分光光吸收法瓊脂糖凝膠電泳檢測法轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第32頁核酸提取中對照設(shè)置空白對照：無菌水作為原材料DNA提取質(zhì)量對照：已知質(zhì)量DNA樣品加入到原材料每次核酸提取應(yīng)設(shè)置2－3個平行重復(fù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第33頁檢測中對照設(shè)置DNA是否提取出來？試驗過程中是否有錯誤？PCR檢測過程中是否有污染？DNA提取中是否有污染？DNA中是否有PCR抑制因子？——已知質(zhì)量DNA樣品加入到原材料——已知質(zhì)量DNA樣品加入到原材料——無菌水空白對照——無菌水空白對照——每個過程試驗設(shè)置平行PCR體系工作是否正常？——擴增靶序列陽性對照轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第34頁Melting94oCMelting94oCAnnealingPrimers50oCExtension72oCTemperature100050Time30x5’3’3’5’3’5’5’5’3’5’3’5’5’5’5’5’3’3’5’3’5’5’3’5’3’5’定性PCR定性PCR檢測方法轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第35頁定性PCR檢測關(guān)鍵因子引物——設(shè)計PCR引物時使用輔助軟件既可節(jié)約時間，也能防止犯錯誤。如Oligo、PrimerExpress、PrimerPrimier5.0、VectorNTIsuite9和PrimerSelect(DNASTARINC)等專業(yè)引物設(shè)計軟件?！飰A基組成、長度及靶序列特異性是決定PCR成敗關(guān)鍵?！锸侵窪NA聚合酶開啟DNA合成時必需一段寡核苷酸，是PCR特異性反應(yīng)關(guān)鍵原因，PCR反應(yīng)產(chǎn)物特異性是由一對上下游引物所決定。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第36頁dNTPs是PCR反應(yīng)過程中DNA合成原材料。普通反應(yīng)中每種dNTP終濃度為20～200

mol/L。三磷酸脫氧核苷酸（dNTPs）dNTP濃度過高，堿基錯誤摻入率增加，低濃度dNTP可提升特異擴增準(zhǔn)確性。反應(yīng)體系中4種dNTPs濃度應(yīng)該相等，以降低合成中因為某種dNTP不足出現(xiàn)錯誤摻入。當(dāng)dNTP終濃度大于50mmol/L時可抑制TaqDNA聚合酶活性。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第37頁TaqDNA聚合酶最早是從一個嗜熱水生菌ThermusaquaticusYT-1菌株中分離純化取得，以后在嗜熱脂肪芽孢桿菌及其它幾個耐熱菌中也分離提純到這類DNA聚合酶。TaqDNA聚合酶酶量過多會使非特異性擴增產(chǎn)物增加，過少則使產(chǎn)量降低。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第38頁反應(yīng)緩沖液反應(yīng)緩沖液普通含有10～50mmol/LTris·Cl，50mmol/LKCl和適當(dāng)濃度Mg2+(普通為1.5mmol/LMgCl2)。Mg2+濃度既影響酶活性和真實性，又影響引物退火和解鏈溫度，影響產(chǎn)物特異性以及引物二聚體形成等，所以，適當(dāng)Mg2+濃度是PCR關(guān)鍵。必要時在反應(yīng)緩沖液中還可加入5mmol/L二硫蘇糖醇（DDT）或100

g/ml牛血清蛋白（BSA），以穩(wěn)定Taq酶活性。50mmol/LKCl有利于引物退火，高于75mmol/L時PCR反應(yīng)顯著受到抑制。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第39頁轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定性PCR檢測方法關(guān)鍵方法特異性9種轉(zhuǎn)基因玉米檢測方法特異性示意圖(A)：GA21玉米；(B)：NK603玉米；(C)：BT176玉米；(D)：CBH351玉米；(E)：MON863玉米；(F)：TC1507玉米；(G)：T25玉米；(H)：BT11玉米；(I)：MON810玉米；(J)：玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb基因。泳道1～14分別是：空白對照、GA21玉米、NK603玉米、BT176玉米、CBH351玉米、MON863玉米、TC1507玉米、T25玉米、BT11玉米、MON810玉米、非轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2、轉(zhuǎn)基因油菜RT73和轉(zhuǎn)基因MON531棉花；泳道M為DLDNA分子量Marker.轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第40頁轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定性PCR檢測方法關(guān)鍵方法檢測極限（LOD）相對LOD值，指是能夠檢測到最低轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品含量，普通是以“xx%”表示；以一系列不一樣轉(zhuǎn)基因含量標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品為PCR擴增模板，經(jīng)過最少三次重復(fù)后，確定能夠取得PCR擴增到DNA樣品最低轉(zhuǎn)基因含量為相對LOD值。絕對LOD值，指是能夠檢測最低轉(zhuǎn)基因植物DNA質(zhì)量，普通是以“xxpg”或“xx拷貝”表示。以純基因組DNA為標(biāo)準(zhǔn)樣品，以不一樣濃度梯度DNA樣品為PCR模板擴增，經(jīng)過最少三次重復(fù)后，確定能夠取得PCR擴增到DNA樣品最低DNA質(zhì)量為絕對LOD值。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第41頁已經(jīng)有轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定性PCR檢測方法

基因特異性：epsps、cry1Ab、Pat、bar、Gox、cry9C、NptII等篩選特異性：CaMV35s開啟子、NOS開啟子和終止子、FMV35s等構(gòu)建特異性：主要轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、油菜、棉花等品系

轉(zhuǎn)化體特異性：主要轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、油菜、棉花等品系上述方法LOD都到達0.1％，且很多已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化成為ISO和我國國家標(biāo)準(zhǔn)?。?！轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第42頁熒光定量PCR（real-timePCR)

經(jīng)過熒光染料或熒光標(biāo)識特異性探針,對PCR產(chǎn)物進行標(biāo)識跟蹤,實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程,結(jié)合對應(yīng)軟件能夠?qū)Y(jié)果進行分析,計算待測樣品初始模板量。定量PCR檢測方法熒光定量PCR儀熒光定量PCR儀是一個帶有激發(fā)光源和熒光信號檢測系統(tǒng)PCR儀,通常配有電腦系統(tǒng)及對應(yīng)分析軟件。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第43頁

capPCRvesselthermalblock

samplelens閉管反應(yīng)

(lowcontaminationrisk)

無需PCR后操作

(nogels,filmsetc)自動化高通量

單一反應(yīng)管檢測能夠同時分析多個反應(yīng)管定量PCR檢測方法轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第44頁定量

real-timePCR檢測原理

fluorescentsignal

PCRcycles

Low

(highcopyno.)HighCT

(lowcopyno.)real-timePCRamplificationplots(7x10-folddilns.+NTC)Endpoint(notquantitative)thresholdofdetectionCT定量PCR檢測方法轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第45頁定量PCR檢測方法×轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第46頁實時定量

PCR與終點法定量PCR比較

傳統(tǒng)PCR終點法定量實時定量PCR法定量定量PCR檢測方法轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第47頁轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實時熒光定量PCR方法絕對定量法，指是利用定量PCR反應(yīng)及其構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，取得檢測樣品中轉(zhuǎn)基因植物基因組或外源目標(biāo)基因質(zhì)量或拷貝數(shù)。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量PCR檢測，主要能夠分為兩種方法：一個是絕對定量法，另一個是相對定量法。相對定量法，是指利用定量PCR反應(yīng)和構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析取得檢測樣品中轉(zhuǎn)基因植物基因組或外源目標(biāo)基因在樣品基因組DNA中百分含量，結(jié)果能夠用轉(zhuǎn)基因基因組DNA和樣品基因組DNA質(zhì)量比或者轉(zhuǎn)基因植物和樣品質(zhì)量比表示。定量PCR檢測方法轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第48頁絕對定量法外源基因標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因標(biāo)準(zhǔn)曲線＊取得是樣品中植物基因組DNA或外源目標(biāo)基因絕對質(zhì)量或拷貝數(shù)。

定量PCR檢測方法基因植物（外源基因）基因組質(zhì)量或拷貝數(shù)×100樣品轉(zhuǎn)基因含量（%）＝植物（內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因）基因組質(zhì)量或拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第49頁相對定量法轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第50頁相對定量法內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因外源基因ΔCT(ΔCT=參考基因CT–轉(zhuǎn)基因CT)值VS轉(zhuǎn)基因含量之間標(biāo)準(zhǔn)曲線定量PCR檢測方法轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第51頁轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第52頁定量PCR方法關(guān)鍵參數(shù)特異性Specificity靈敏度Sensitivity準(zhǔn)確度Accuracy重復(fù)性Repeatability重演性Reproducibility轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第53頁特異性與靈敏度只能在含有靶序列轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中檢測出陽性信號!需要測試不一樣植物品種需要測試不一樣轉(zhuǎn)基因植物足夠低檢測靈敏度，滿足轉(zhuǎn)基因標(biāo)識要求檢測極限（LOD）定量極限（LOQ）轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第54頁正確度高精度不過遠離真實值轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第55頁靠近真實值不過精度較低轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第56頁靠近真實值高精度轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第57頁重復(fù)性在試驗室內(nèi)部不一樣重復(fù)下精度一樣方法r轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第58頁重復(fù)條件下精度一樣方法不一樣試驗室國際間試驗室、國內(nèi)不一樣試驗室R重復(fù)性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第59頁定量PCR方法可接收和應(yīng)用基本要求ApplicabilityScopeofthemethod,interferenceswithanalytesetc.PracticabilityEquipment,timing,practicaldifficultiesSpecificityEvent-specificityDynamicRangeIncludethe1/10andatleast5timesthetargetconcentrationAccuracyWithin±25%ofthereferencevalueR2Coefficient0.98PCRefficiency-3.1slope3.6RSDrBelow25%overthewholedynamicrangeLOQLessthan1/10thofthevalueofthetargetconcentrationwithanRSDr25%LODLessthan1/20thofthetargetconcentrationRobustnessDeviatenotmorethan±30%RSDRBelow35%atthetargetconcentration;<50%below0.2%TruenessWithin±25oftheacceptedreferencevalueoverthewholerange轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第60頁完成驗證方法44個，正在進行中31個！轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第61頁普通性標(biāo)準(zhǔn)和要求蛋白檢測采樣核酸檢測核酸提取定性PCR檢測定量PCR檢測核酸檢測方法增補標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成份檢測ISO標(biāo)準(zhǔn)ISO24276:，Generalrequirementsanddefinitions

ISO21571:NucleicacidextractionISO21570:QuantitativenucleicacidbasedmethodsISO21572:ProteinbasedmethodISO/TS21098:InformationtobesuppliedandprocedurefortheadditionofmethodstoISO21569,ISO21570orISO21571prENISO21568:Sampling21569:Qualitativenucleicacidbasedmethods轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第62頁21570:Quantitativenucleicacidbasedmethods定量PCR等名詞術(shù)語PCR技術(shù)原理PCR操作程序等附錄A植物種特異性檢測方法附錄B篩選檢測方法附錄C構(gòu)建特異性檢測方法附錄D轉(zhuǎn)化事件特異性檢測方法轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第63頁附錄A植物種特異性檢測方法

玉米品種（adh1gene）檢測方法附錄B篩選檢測方法

GTS40-3-2大豆中CaMV35S開啟子檢測方法附錄C構(gòu)建特異性檢測方法

GTS40-3-2大豆檢測方法（3個）Bt176玉米檢測方法（2個）Bt11玉米檢測方法T25玉米檢測方法GA21玉米檢測方法MON810玉米檢測方法附錄D轉(zhuǎn)化事件特異性檢測方法Bt11玉米檢測方法MON810玉米檢測方法轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第64頁熒光染料：

SYBRGreenI、EvaGreen

實時熒光定量PCR熒光探針類型和基本原理引物特異性探針：

Amplifluor(Intergen)Scorpions探針通用模板探針（AUDP,UT）LUX（LightUponExtension）探針序列特異性探針：熒光能量共振轉(zhuǎn)移探針（FRET)

雙標(biāo)探針（TaqMan、TaqManMGB、LNA、Allglo）分子信標(biāo)（MolecularBeacons，MB)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第65頁5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-GreenI原理熒光染料轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第66頁5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmission定量PCR檢測方法轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第67頁優(yōu)點：（1）高度通用性，幾乎能夠用于任何型號定量PCR儀和任何目標(biāo)DNA序列擴增。（2）無需另外設(shè)計熒光探針，無需尤其優(yōu)化條件，簡便易行，成本較低。（3）PCR反應(yīng)后能夠進行融解曲線分析，分析反應(yīng)特異性和目標(biāo)序列突變等。定量PCR檢測方法缺點：（1）不具備目標(biāo)序列特異性，不能用于MultiplexPCR反應(yīng)，輕易受污染物，非特異性擴增產(chǎn)物和引物二聚體干擾。（2）定量準(zhǔn)確性不高，重復(fù)性不強。（3）高濃度染料會抑制PCR反應(yīng)。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第68頁Oligo1:FluoresceinOligo2:LCRed640ExcitationEmissionTransfer2.2.1熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針（FRETProbe）序列特異型探針轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第69頁優(yōu)點：（1）為雜交型探針，本身不被降解，其熒光信號是可逆，PCR反應(yīng)后能夠進行融解曲線分析，突變分析，SNP基因分型以及產(chǎn)物判別。（2）包含兩條探針，具備很高目標(biāo)序列特異性，不受引物二聚體和非特異擴增影響。缺點：因為需要合成兩條探針，探針末端要封閉以防止延伸反應(yīng)，所以合成成本會比較高，也比較麻煩。序列特異型探針轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第70頁RQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitation2.2.2雙標(biāo)識探針（TaqManProbe）序列特異型探針轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第71頁優(yōu)點：（1）具備目標(biāo)序列特異性，良好穩(wěn)定性和靈敏度。（2）有各種不一樣波長熒光基團對可供選擇，能夠?qū)崿F(xiàn)在同一管內(nèi)檢測MultiplexPCR，降低成本也提升效率和準(zhǔn)確性。（3）探針本身對PCR反應(yīng)影響較小，定量準(zhǔn)確性高。序列特異型探針

TaqMan是應(yīng)用最廣泛，最成熟熒光定量技術(shù)，廣泛應(yīng)用于人類傳染病診療、動物疾病檢測以及轉(zhuǎn)基因作物定量檢測等。缺點：（1）探針設(shè)計有一定難度，需要驗證效果，探針合成和雙熒光標(biāo)識成本高。(2)探針較長使得兩端基團距離較遠，造成熒光淬滅不徹底，而且淬滅基團也會產(chǎn)生不一樣波長熒光，本底信號偏高，信噪比不高。（3）其為水解型探針，反應(yīng)中探針會水解，熒光信號不可逆，不能用于融解曲線分析。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第72頁TaqManMGB

針對Taqman探針熒光淬滅不徹底問題，年美國ABI企業(yè)推出了一個新TaqMan探針,即TaqManMGB，其工作原理與TaqMan探針相同。序列特異型探針轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第73頁TaqManMGB優(yōu)點（1）3‘端采取了非熒光性淬滅基因。（2）MGB探針3‘端還連接了一個二氫環(huán)化吲哚卟啉-三肽(dehydrocyclopyrroindoletripetide,DPI3)，能夠大大穩(wěn)定探針與模板雜交,升高探針Tm值，提升探針特異性。（3）探針能夠設(shè)計得更短，熒光匯報基團和淬滅基團距離更近,淬滅效果更加好，熒光背景更低，使得信噪比更高。

（4）MGB探針對于等位基因區(qū)分比較理想，能夠檢測單堿基突變?，F(xiàn)在它也是轉(zhuǎn)基因作物定量檢測中一個慣用定量技術(shù)。序列特異型探針轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第74頁RQExcitationXRQQRExcitationEmission分子信標(biāo)（MolecularBeaconProbe）序列特異型探針轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第75頁優(yōu)點:（1）本底信號低，特異性和靈敏度高（2）為雜交型探針，能夠用于融解曲線分析。缺點:(1)雜交時探針不能完全與模板結(jié)合，所以穩(wěn)定性較差。(2)探針合成時標(biāo)識較復(fù)雜。分子信標(biāo)是轉(zhuǎn)基因定量檢測慣用技術(shù)，它還能夠用于突變檢測，SNP檢測，在其基礎(chǔ)上發(fā)展技術(shù)有Amplifluor、Sunrise、Amplisensor、Scorpion等。序列特異型探針轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第76頁當(dāng)前慣用序列特異性探針比較序列特異型探針轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第77頁5’3’5’3’5’3’5’3’3’RQ5’RQRQ3’5’QRRREmissionExcitationQR2.3.1Amplifluor引物特異性探針轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第78頁優(yōu)點：1它是引物特異性探針，不需要引物以外探針，節(jié)約成本，反應(yīng)體系優(yōu)化愈加方便。2它是積累性熒光，信號不可逆，可用于融解曲線分析。3其探針序列是通用，可用于檢測任何目標(biāo)序列，更節(jié)約成本。缺點：（1）對引物擴增效率影響比較大，影響定量準(zhǔn)確性。（2）其穩(wěn)定性不太好，其莖環(huán)結(jié)構(gòu)對其標(biāo)識染料淬滅能力有限，輕易出現(xiàn)淬滅不徹底，造成本底信號強。該技術(shù)是在分子信標(biāo)基礎(chǔ)上發(fā)展而來技術(shù)，具備了分析信標(biāo)普通特點。定量PCR檢測方法轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第79頁LUX探針LUX?（LightUponeXtension）效應(yīng)工作原理定量PCR檢測方法轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第80頁通用模板（UniversalTemplate,UT）探針

1stcycle2ndcycle定量PCR檢測方法轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第81頁優(yōu)點（1）該探針序列是通用，可用于任何目標(biāo)序列特異性檢測，兼具通用性和高度特異性（2）探針設(shè)計簡單，使用方便，成本相對較低缺點（1）因為探針雜交在引物上，特異性取決于引物特異性（2）與TaqMan相同，存在淬滅不徹底，本底信號偏高問題（3）探針位于擴增片段末端，對于Taq酶外切酶活性要求較高定量PCR檢測方法轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第82頁定量PCR檢測方法AUDP探針（attacheduniversalduplexprobes）轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第83頁優(yōu)點：

DNA聚合酶要求較低長片段DNA序列分析能力強通用性強檢測費用低熒光信號熒光信號強度高而且穩(wěn)定

缺點：需要合成兩條引物，原理復(fù)雜；熒光信號產(chǎn)生比較晚。定量PCR檢測方法轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第84頁四、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測新技術(shù)和趨勢芯片檢測技術(shù)復(fù)合PCR技術(shù)等溫擴增技術(shù)傳感器技術(shù)光譜學(xué)技術(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第85頁什么是基因芯片技術(shù)？簡單概括就是將大量探針分子固定于支持物上，依據(jù)堿基互補配對原理，與標(biāo)識樣品分子進行雜交，經(jīng)過檢測雜交信號強度及分布進而獲取樣品中靶分子數(shù)量和序列信息?；蛐酒驹恚炕蛐酒ぷ髟砼c經(jīng)典核酸分子雜交方法(southern、northern)一致，應(yīng)用已知核酸序列作為探針與互補靶序列雜交，經(jīng)過隨即信號檢測進行定性與定量分析?；蛐酒瑱z測技術(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第86頁基因芯片發(fā)展歷史Southern&Northern雜交斑點雜交宏芯片Macroarray微芯片Microarray基因芯片檢測技術(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第87頁低密度芯片探針數(shù)量普通在幾十或者幾百個之間。主要用于少數(shù)目標(biāo)基因和序列檢測及確認。依據(jù)已知靶序列設(shè)計針對性探針。高密度芯片探針數(shù)量能夠到達幾千甚至數(shù)萬。主要用于大規(guī)?；驒z測、篩選等。依據(jù)生物體全基因組已知基因信息甚至只依據(jù)序列信息設(shè)計探針。該芯片技術(shù)要求復(fù)雜，價格昂貴?；蛐酒瑱z測技術(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第88頁(i)提取樣品：裂解細胞，提取DNA（或者RNA）并純化。(iii)雜交和沖洗：按堿基配對原理DNA/cDNA樣品與芯片探針進行雜交，然后對芯片進行清洗。非特異性結(jié)合能夠部分沖洗掉。(iv)掃描和成像：用適當(dāng)方法使標(biāo)識底物激發(fā)熒光或者顯色，掃描儀器統(tǒng)計每個樣點信號值，樣點信號強度取決于雜交樣品DNA/cDNA量。(v)數(shù)據(jù)處理與分析。讀取芯片樣點信號值，對信號進行標(biāo)準(zhǔn)化等處理，經(jīng)過計算機分析得出結(jié)果。工作流程(ii)樣品擴增與標(biāo)識：樣品DNA/RNA經(jīng)過PCR擴增、反轉(zhuǎn)錄等技術(shù)擴增并摻入熒光標(biāo)識分子或放射性同位素?；蛐酒瑱z測技術(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第89頁基因芯片在轉(zhuǎn)基因檢測中應(yīng)用:當(dāng)前報道基因芯片用于轉(zhuǎn)基因檢測應(yīng)用包含以下方面。利用低密度芯片進行定性檢測。該方法是當(dāng)前研究和應(yīng)用最廣泛芯片檢測方法，將針對特異序列設(shè)計探針用點樣法點在芯片上。一張芯片能夠檢測幾個甚至十幾個轉(zhuǎn)基因品系。利用低密度芯片進行半定量或定量檢測。該方法基本原理與定性檢測方法相同，不一樣是采取特殊設(shè)計樣品擴增方法，建立起DNA樣品起始量與擴增后樣品熒光量關(guān)系，經(jīng)過檢測芯片雜交信號強度確定起始樣品量。利用覆瓦式芯片檢測未知轉(zhuǎn)基因樣品。當(dāng)前仍在發(fā)展階段。該方法利用轉(zhuǎn)基因相關(guān)載體設(shè)計探針，使探針覆蓋大量轉(zhuǎn)化載體序列，從而到達檢測未知樣品目標(biāo)。下面對這三種應(yīng)用分別舉例說明?；蛐酒瑱z測技術(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第90頁利用低密度芯片檢測食品中轉(zhuǎn)基因成份SergeLeimanis.etal.PlantMolecularBiology()能夠同時檢測9種轉(zhuǎn)基因品系、確定5種植物物種以及三種轉(zhuǎn)基因篩選元件。DNA樣品在擴增時標(biāo)識生物素，擴增產(chǎn)物直接與芯片雜交，經(jīng)過隨即顯色步驟檢測芯片雜交情況，確定樣品中所含成份?；蛐酒瑱z測技術(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第91頁芯片探針設(shè)計第一部分品系特異性芯片-針對品系特異性探針第二部分物種特異性芯片-針對內(nèi)標(biāo)基因探針第三部分篩選特異性芯片-針對篩選元件探針第四部分對照探針基因芯片檢測技術(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第92頁利用基因芯片定量檢測轉(zhuǎn)基因成份經(jīng)過特殊設(shè)計樣品DNA擴增方法實現(xiàn)定量檢測目標(biāo)。芯片PCR技術(shù)1、在芯片上固定反向引物作為探針2、特異性靶標(biāo)與引物退火結(jié)合3、固定引物延伸4、變性后正向引物退火延伸5、特異性序列在芯片上擴增基因芯片檢測技術(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第93頁利用Tiling芯片檢測未知轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品依據(jù)一系列轉(zhuǎn)化載體作為參考序列設(shè)計高密度基因芯片，然后將全基因組DNA直接與芯片雜交，以檢測未知轉(zhuǎn)基因物種。設(shè)計25bp長度探針對235個植物轉(zhuǎn)化載體雙鏈序列(約2兆個堿基)進行覆蓋。經(jīng)過篩選得到37257個探針。利用該芯片檢測出了3種轉(zhuǎn)化載體或者T-DNA序列未知轉(zhuǎn)基因擬南芥和水稻品系。該方法靈敏度僅要求樣品DNA中含有一段大于140bp與參考序列匹配片段存在即可得到陽性結(jié)果。TorsteinTengsetalBMCBiotechnology,7:91基因芯片檢測技術(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第94頁圖中粗黑線為部分檢測結(jié)果，以及該序列在基因組上位置。但該結(jié)果表明此方法當(dāng)前只能檢測離散轉(zhuǎn)基因通用元件?；蛐酒瑱z測技術(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第95頁基因芯片技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測中應(yīng)用前景集成芯片，利用一塊芯片能夠檢測當(dāng)前商業(yè)化轉(zhuǎn)基因品系。定量芯片，愈加準(zhǔn)確和高通量定量檢測芯片技術(shù)。Tiling芯片，檢測未知轉(zhuǎn)基因樣品并可對其分子特征進行描述。高密度基因組芯片，研究轉(zhuǎn)基因事件非預(yù)期效應(yīng)，包含在基因組水平上DNA插入、缺失、擴增、位移等以及轉(zhuǎn)錄組水平上基因表示緘默、激活、上調(diào)、下調(diào)等?；蛐酒瑱z測技術(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第96頁定義是指在一個單一反應(yīng)體系中加入一對以上特異引物對，從而同時擴增多個序列。復(fù)合PCR檢測技術(shù)方法分類Multiplex-PCR(conventionalPCR)Multiplex-PCR&CGEMultiplex-PCR&MicroarrayMultiplex-PCR&SYBRGreenI轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第97頁Multiplex-PCR傳統(tǒng)復(fù)合定性PCR方法經(jīng)過優(yōu)化各個引物對之間濃度比，到達同時特異性擴增目標(biāo)。同時擴增8種轉(zhuǎn)基因玉米多重PCR——Harik.etal,復(fù)合PCR檢測技術(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第98頁檢測LOD能夠到達0.25%，這種方法快速，靈敏，高特異性，價格低廉，方便操作，可用于日常轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測。Harik.etal,復(fù)合PCR檢測技術(shù)Multiplex-PCR(conventionalPCR)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第99頁Multiplex-PCR&CGE多重PCR結(jié)合酶切分析-毛細管電泳檢測基于多重PCR產(chǎn)物擴增，其特異性引物在一端都標(biāo)識了6-FAM熒光基團。PCR產(chǎn)物經(jīng)過特異性內(nèi)切酶進行酶切消化，從而產(chǎn)生特異性酶切片段。酶切片段進行毛細管電泳（CGE)熒光檢測，經(jīng)過產(chǎn)生預(yù)期熒光信號，從而確定轉(zhuǎn)基因陳分存在復(fù)合PCR檢測技術(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第100頁Multiplex-PCR&CGE-LIF分析同時含有轉(zhuǎn)基因玉米MON863和GA21混合樣品

——Virginia.etal,這種方法能夠同時檢測多個目標(biāo)片段，高通量，高靈敏度。唯一缺點在于設(shè)備比較昂貴。復(fù)合PCR檢測技術(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第101頁Sidneyetal,復(fù)合PCR檢測技術(shù)同時檢測12個靶序列Multiplex-PCR&Microarray多重PCR結(jié)合基因芯片技術(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第102頁Multiplex-PCR&MicroarraySidneyetal,復(fù)合PCR檢測技術(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第103頁Multiplex-PCR&MicroarraySidneyetal,這種方法也是高效，而且高通量。唯一不足在于所需儀器設(shè)備比較昂貴。復(fù)合PCR檢測技術(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第104頁依據(jù)PCR產(chǎn)物Tm值不一樣對多重PCR產(chǎn)物進行檢測！復(fù)合PCR檢測技術(shù)Multiplex-PCR&SYBRGreenI轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第105頁復(fù)合PCR檢測技術(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第106頁用染料avagreen，對1445,531,88913,15985,sadIPCR產(chǎn)物進行熔解曲線分析1445413bpTm=95.24℃531351bpTm=88.0℃88913231bpTm=79.2℃15985175bpTm=78.1℃SadI107bpTm=83.6℃復(fù)合PCR檢測技術(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第107頁15985175bp78.1℃SadI107bp83.6℃88913231bp79.2℃531346bp86.0℃1445413bp95.4℃復(fù)合PCR檢測技術(shù)這種方法對于儀器要求相對較低、操作簡單、試驗時間短，不過不能檢測太多目標(biāo)靶序列！轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第108頁LAMP（loop-mediatedisothermalamplification）LAMP即環(huán)介導(dǎo)等溫PCR，是由NotomiT等在年創(chuàng)造一個新奇恒溫核酸擴增方法LAMP基本原理是針對靶基因6個區(qū)域，設(shè)計4條特異性引物，利用一個鏈置換DNA聚合酶在恒溫65℃左右反應(yīng)1小時B2B3F3FIPF2F1CB3B2B1F1CF2CF3CB3CB2CB1CF1F2F3BIPB1C等溫擴增技術(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第109頁第一階段：莖環(huán)產(chǎn)生階段第二階段：循環(huán)擴增階段等溫擴增技術(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第110頁Lectin

Mon897883’RRS特異性和靈敏度M1234567891011M1234567891011M123456789101112

Mon897885’LaneM-11M：mark，1：空白，2：89788-3’/5’/RRS，3：MON810，4：GT73，5：棉花，6：轉(zhuǎn)基因番茄，7：非轉(zhuǎn)大豆，8：煙草，9：花生，10：芝麻，11：蕎麥LaneM-12M：mark，1：空白，2：89788，3：RRS，4：MON810，5：GT73，6：棉花，7：轉(zhuǎn)基因番茄，8：非轉(zhuǎn)大豆，9：煙草，10：花生，11：芝麻，12：蕎麥等溫擴增技術(shù)M1234567891011轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第111頁LAMP優(yōu)點1操作簡便：不需要復(fù)雜儀器，不需要特殊試劑，只需用水浴鍋就可完成反應(yīng)2高特異性：LAMP由4條引物擴增靶序列6個區(qū)段3快速、高效：整個擴增30分鐘即可完成4靈敏度高：擴增?？蓛H為1拷貝等溫擴增技術(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第112頁LAMP技術(shù)應(yīng)用當(dāng)前LAMP技術(shù)廣泛應(yīng)用于細菌、病毒檢測中LAMP技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測中應(yīng)有極少等溫擴增技術(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第113頁等溫擴增技術(shù)NucleicAcidSequence-BasedAmplification(NASBA)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第114頁WP5&&meeting11-12MayLjubljanassRNA/sscDNAsecondspecificprimerReverseTranscriptionRNAseHactivityT7-specificprimer100-1000copiesNASBAprinciplePrimerextensionTranscriptionT7-RNApolymerasepromotersequence+specificsequenceSecondtargetspecificsequence3’5’RNA3’cDNA(-)ReverseTranscription5’5’dscDNA3’RNApolPrimerextension5’3’3’5’ssDNA5’5’3’RNA(-)3’3’3’3’3’3’3’3’3’轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第115頁116轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測中應(yīng)用4ampliconswereassayedforsingleplexqualitativeandquantitativedetection:IVR,35S,tNOS,Mon810Specificitysuccessfullyassayedonwild-typemaize,Mon810,Mon863andGA21maize,RRSoya,EH592-527-1potatoandfoodandfeedsamples.Highamplification(>1.106insingleplex)25minamplificationsufficientAmpliconstested

Samples

35S

IVR

tNOS

GA21

+*

+

+

RRS

+

-

+

EH92potato

-

-

+

G004/07(soyskins)

+

+*

+

G090/09(negativeoilseedrape)

-

-

-

G033/07(feed,onlyIVR)

-

+

-

Mon810DNA+

+

-

Mon863DNA+++*-atracewasdetected–presenceconfirmedwithquantitativePCR轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第116頁QuantitativeaspectsLinearamplificationinashorttime(5to25min)Assessmentofthesensitivityandlinearityofamplification(serialdilution)Goodsensitivity(absLODbetween2and11copies)Broadlinearrange(>3log10)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第117頁Triplex:sensitivityandlinearityScreening(IVR*P35S*tNOS)andMon810(IVR*P35S*Mon810)AssessedonserialdilutionsSamelinearrangeasforsingleplex(>3log10)Samesensitivityasforsingleplex(downto2copies)Sameamplificationprofileasforsingleplex轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第118頁NASBA操作簡單，是一個恒溫反應(yīng)，反應(yīng)溫度為41C，不需要熱循環(huán)儀，同PCR相比，以RNA為模板，不受背景中DNA干擾，不易發(fā)生交叉污染。整個反應(yīng)過程由三種酶控制，循環(huán)次數(shù)少，忠實性高，其擴增效率高于PCR，特異性好。優(yōu)點：轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第119頁廣泛用于禽流感病毒、新城疫病毒、口蹄疫病毒、狂犬病病毒和產(chǎn)單核細胞李斯特菌檢測和研究中國家公布這次公布8項禽流感系列標(biāo)準(zhǔn)中,有兩項應(yīng)用了NASBA檢測方法NASBA應(yīng)用等溫擴增技術(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第120頁展望盡管PCR有著各種各樣優(yōu)點，但在應(yīng)用方面，還有其本身缺點：比如，循環(huán)中需要高精度溫度循環(huán)，擴增抑制劑對靈敏度影響等等溫擴增技術(shù)高靈敏度、高特異性、操作簡便，不需要昂貴儀器和試劑，花費時間少全部這些技術(shù)使快速、準(zhǔn)確、簡便、高效、低消耗和適用面廣轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)成為可能。等溫擴增技術(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第121頁傳感器(Biosensor)

表面等離子共振式傳感器(Opticalbiosensors)壓電式傳感器(Piezoelectricbiosensors)電化學(xué)式傳感器(Electrochemicalbiosensors)傳感器檢測技術(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)和其進展第122頁表面等離子共振式傳感器(Opticalbiosensors)原