小牛椎體骨質(zhì)疏松模型的快速建立

小牛椎體骨質(zhì)疏松模型的快速建立【摘要】目的：利用乙二胺四乙酸二鈉脫鈣法快速建立牛椎體骨質(zhì)疏松模型.方法：4具新鮮小牛脊柱，每具選取第6～13節(jié)椎體，共32個(gè)椎體，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)方法，分成Ⅰ~Ⅷ共8個(gè)區(qū)組；采用4種處理方法：A處理組，B處理組，C處理組，D處理組.分別檢測(cè)各組椎體骨密度(BMD)后，擰入相同規(guī)格的通用性脊柱內(nèi)固定系統(tǒng)椎弓根螺釘，測(cè)試其最大軸向拔出力及能量吸收值，同時(shí)各組取少量松質(zhì)骨制成組織切片.結(jié)果：A，B，D處理組的BMD均值，F(xiàn)max均值及能量吸收值均值都低于C處理組，A，D處理組的BMD均值，F(xiàn)max均值及能量吸收值均值都低于B處理組，A，D處理組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.切片顯示A，D處理組骨小梁較C組骨小梁變細(xì)、數(shù)量輕度減少,間距增寬,骨髓腔擴(kuò)大.結(jié)論：應(yīng)用EDTANa2對(duì)牛椎體進(jìn)行脫鈣，可在較短的時(shí)間內(nèi)建立用于生物力學(xué)研究的牛椎體骨質(zhì)疏松模型.

【關(guān)鍵詞】骨質(zhì)疏松；疾病模型，動(dòng)物；生物力學(xué)；EDTANa2；骨密度

0引言

由于骨質(zhì)疏松造成的椎弓根螺釘松動(dòng)、拔出的情況在臨床工作中很常見(jiàn)，給脊柱外科手術(shù)帶來(lái)了極大困難［1］.如何提高椎弓根螺釘在骨質(zhì)疏松患者的固定強(qiáng)度已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn).本實(shí)驗(yàn)利用乙二胺四乙酸二鈉對(duì)新鮮小牛椎體進(jìn)行脫鈣處理，以期為相關(guān)研究建立一種簡(jiǎn)便、快捷的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?

1材料和方法

材料新鮮小牛脊柱4具，每具選取第6～13椎體，8節(jié)共32個(gè)椎體，X線(xiàn)和骨密度檢查均無(wú)明顯的骨質(zhì)疏松、先天性畸形、骨折和腫瘤等病變；去除軟組織，分解為單個(gè)椎體并保持每個(gè)椎體的完整性.EDTANa2，NaOH(天津市化學(xué)試劑三廠(chǎng))；椎弓根螺釘采用通用性脊柱內(nèi)固定系統(tǒng)釘；雙能X線(xiàn)吸收骨密度儀(美國(guó)LunarCorp公司)；拉伸試驗(yàn)機(jī)(AGSJ,日本島津公司)；leicaLA全自動(dòng)研究顯微鏡.

方法

實(shí)驗(yàn)分組采用隨機(jī)區(qū)組的設(shè)計(jì)方法.4具新鮮小牛脊柱，每具選取第6～13節(jié)椎體共8節(jié)椎體，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)方法分成Ⅰ～Ⅷ共8個(gè)區(qū)組；根據(jù)隨機(jī)原則，分配至4個(gè)處理組：A處理組，B處理組，C處理組，D處理組.

標(biāo)本脫鈣處理所有椎體均用標(biāo)準(zhǔn)mm絲攻預(yù)制雙側(cè)椎弓根釘?shù)?，然后浸?0g/L甲醛固定6h，再取出清水沖洗、浸泡12h.C處理組不用EDTANa2脫鈣處理；A，B，D處理組用mol/L的EDTANa2脫鈣液2400mL.

標(biāo)本檢測(cè)分別于2，3和4wk后從脫鈣液中取出A，B，D處理組，使用雙能X線(xiàn)吸收BMD儀分別檢測(cè)每個(gè)椎體的BMD；隨后在每個(gè)椎體雙側(cè)擰入U(xiǎn)PASS椎弓根螺釘，用超硬石膏垂直包埋于特制鋼制容器中，采用日本島津AGSJ系列拉伸試驗(yàn)機(jī)，以5mm/min的速度軸向牽拉，直至螺釘被拉出，記錄最大軸向拔出力(Fmax)及能量吸收值.

組織切片觀(guān)察A，B，C，D各組中分別取釘?shù)乐鼙谒少|(zhì)骨制作組織切片，leicaLA顯微鏡下觀(guān)察.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用統(tǒng)計(jì)軟件分析.不同處理組BMD均值、Fmax均值及能量吸收值均值均采用隨機(jī)區(qū)組的方差分析及Dunnettt檢驗(yàn)進(jìn)行比較，BMD與Fmax作Pearson相關(guān)分析,MicrosoftOfficeExcel2003軟件制圖表.為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2結(jié)果

,Fmax,能量吸收值各處理組的BMD，F(xiàn)max和能量吸收值均值.通過(guò)隨機(jī)區(qū)組的方差分析，結(jié)果顯示，A，B，D處理組的BMD均值、Fmax均值及能量吸收值均值都低于C處理組，A，D處理組的BMD均值、Fmax均值及能量吸收值均值都低于B組，A和D處理組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

表1各不同處理組的骨密度、最大軸向拔出力(Fmax)和能量吸收值

vsC.

脫鈣時(shí)間對(duì)BMD和Fmax的影響脫鈣的時(shí)間越長(zhǎng)，BMD越低；脫鈣的時(shí)間越長(zhǎng)，椎弓根螺釘?shù)腇max也越小.

圖1骨密度時(shí)間變化

圖2最大軸向拔出力時(shí)間變化

和Fmax的相關(guān)性分析將BMD與Fmax進(jìn)行相關(guān)性分析，Pearson相關(guān)系數(shù)r=，，顯示BMD與椎弓根螺釘?shù)腇max存在線(xiàn)性正相關(guān).

組織切片觀(guān)察組織切片結(jié)果顯示,C處理組骨組織中骨小梁豐富,相互交連成網(wǎng)狀；A處理組,D處理組骨小梁與C處理組相比，骨小梁變細(xì)、數(shù)量減少,相互聯(lián)結(jié)分離,間距增寬,骨髓腔擴(kuò)大，但變化均勻，保持了松質(zhì)骨正常的形態(tài)結(jié)構(gòu).

圖3骨密度與椎弓根螺釘最大軸向拔出力的散點(diǎn)圖

3討論

近年來(lái)椎弓根螺釘固定技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于治療脊柱退行性病變，骨折，畸形等病癥［2-3］，但是在骨質(zhì)疏松的患者，椎弓根螺釘?shù)乃蓜?dòng)、拔出的情況卻很常見(jiàn)，并且隨著人類(lèi)壽命的延長(zhǎng)和我國(guó)老齡化社會(huì)的到來(lái)，這一問(wèn)題越來(lái)越突出.為解決這一問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外開(kāi)展了大量的研究［4］，目前用于脊柱生物力學(xué)研究的骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型是以去勢(shì)雌性山羊?yàn)榇淼膭?dòng)物模型［5-8］，但也存在下列幾點(diǎn)不足：①模型建立時(shí)間長(zhǎng)：目前公認(rèn)需6mo左右；②建立過(guò)程繁瑣且費(fèi)用高：需先為羊做去勢(shì)手術(shù)，術(shù)后還需行消炎等治療；需飼養(yǎng)6mo方能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；③模型的可靠性差：季節(jié)、生育、營(yíng)養(yǎng)狀況、健康狀況、接受光照情況等不確定因素都可以影響模型BMD的變化，導(dǎo)致模型的可靠性較差.所以，建立一個(gè)快速、簡(jiǎn)便且滿(mǎn)足脊柱生物力學(xué)研究需要的骨質(zhì)疏松模型就顯得非常必要.

本實(shí)驗(yàn)中選用EDTANa2作為脫鈣劑，相對(duì)于HCL等其它脫鈣劑，雖然脫鈣速度慢，但有一個(gè)突出優(yōu)點(diǎn)——對(duì)細(xì)胞等微觀(guān)結(jié)構(gòu)的破壞要小的多；實(shí)驗(yàn)中加入NaOH以調(diào)整pH值為，也是防止pH值過(guò)低對(duì)椎體微觀(guān)結(jié)構(gòu)的破壞.用20mL注射器將浸泡椎體的脫鈣液向每個(gè)椎弓根釘?shù)纼?nèi)注射2次/d，能促使脫鈣液更好的進(jìn)入椎體內(nèi)部，起到更好的脫鈣效果.每周更換相同濃度和量的脫鈣液1次，以保持相對(duì)恒定的脫鈣液濃度，這樣既加強(qiáng)了脫鈣的效果，又排除了脫鈣液濃度變化對(duì)脫鈣效果的影響，以便更好的觀(guān)察脫鈣時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)BMD的影響.

實(shí)驗(yàn)中采用每具小牛脊柱的第6～13節(jié)椎體共8節(jié)椎體，是由于這8節(jié)椎體的形態(tài)結(jié)構(gòu)及大小很接近，且和人體的胸腰椎結(jié)構(gòu)相似.通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，發(fā)現(xiàn)隨著脫鈣時(shí)間的延長(zhǎng)，BMD明顯下降，椎弓根螺釘?shù)腇max均值及能量吸收值均值也都明顯下降.目前臨床上一般將BMD下降到相同人種、相同性別年齡組人群BMD均值75％~87％的患者診斷為骨量減少，BMD低于75％的患者診斷為骨質(zhì)疏松，BMD低于63％的患者診斷為嚴(yán)重骨質(zhì)疏松［9-10］.采用這一標(biāo)準(zhǔn)，將C處理組與A，B，D處理組對(duì)照，均已滿(mǎn)足建立動(dòng)物椎體骨質(zhì)疏松模型的要求.通過(guò)對(duì)BMD與椎弓根螺釘Fmax進(jìn)行相關(guān)性分析，得出BMD與Fmax存在正相關(guān)，也進(jìn)一步證明了BMD的減低將直接影響椎弓根螺釘?shù)墓潭◤?qiáng)度.

綜上所述，用mol/L的EDTANa2脫鈣液對(duì)牛椎體進(jìn)行脫鈣處理，完全可以滿(mǎn)足建立用于生物力學(xué)研究的牛椎體骨質(zhì)疏松模型的需要，其優(yōu)點(diǎn)：①快速、簡(jiǎn)便、費(fèi)用低；②可靠性好；③通過(guò)調(diào)整脫鈣的時(shí)間，還可以調(diào)控模型的骨質(zhì)疏松程度.該模型作為離體模型，雖不能替代去勢(shì)雌性山羊?yàn)榇淼幕铙w動(dòng)物模型，但可以快速、準(zhǔn)確的為脊柱生物力學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究提供驗(yàn)證數(shù)據(jù)，從而為進(jìn)一步的活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可靠的依據(jù).

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