質(zhì)粒抽提原理及詳細(xì)操作步驟

質(zhì)粒抽提,實(shí)驗(yàn)室必備技能之一質(zhì)粒質(zhì)粒存在于許多細(xì)菌以及酵母菌等生物中，是細(xì)胞染色體外能夠自主復(fù)制的很小的環(huán)狀DNA分子。質(zhì)粒抽提從細(xì)菌中分離質(zhì)粒DNA的方法包括3個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；分離和純化質(zhì)粒DNA。采用強(qiáng)堿液、加熱或溶菌酶（主要針對革蘭氏陽性細(xì)菌）可以破壞菌體細(xì)胞壁，十二烷基磺酸鈉（SDS）和TritonX-100（一般很少使用）可使細(xì)胞膜裂解。經(jīng)溶菌酶和SDS或TritonX-100處理后，細(xì)菌染色體DNA會(huì)纏繞附著在細(xì)胞碎片上，同時(shí)由于細(xì)菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多，易受機(jī)械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當(dāng)用強(qiáng)熱或酸、堿處理時(shí)，細(xì)菌的線性染色體DNA變性，而共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(CovalentlyclosedcircularDNA，簡稱cccDNA）的兩條鏈不會(huì)相互分開。當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時(shí)，線狀染色體DNA片段難以復(fù)性，而是與變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起，而質(zhì)粒DNA雙鏈又恢復(fù)原狀，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中。質(zhì)粒抽提最常用的方法是堿裂解法，它具有得率高、適用面廣、快速和純度高等特點(diǎn)。當(dāng)然，堿裂解法也有缺陷：容易導(dǎo)致不可逆的變性。要降低不可逆的變性，就要控制好堿裂解的時(shí)間。堿裂解法抽提質(zhì)粒需要用到以下三種溶液溶液Ⅰ50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0），在15psi壓力下蒸汽滅菌15min，4℃保存。溶液Ⅱ

0.2mmol/LNaOH（從10mmol/L貯存液中現(xiàn)用現(xiàn)稀釋），10g/LSDS（室溫保存）。溶液Ⅲ5mol/L乙酸鉀60.0mL，冰乙酸11.5mL，無菌水28.5mL，

4℃保存，使用時(shí)置于冰浴中。

下面介紹一下堿裂解法小提質(zhì)粒的具體操作：01柱平衡：向吸附柱中加入500μl平衡Buffer，12000rpm離心30-60s，倒掉收集管中的廢液；注意：吸附柱平衡后可最大限度激活硅基質(zhì)膜，提高質(zhì)粒的得率；吸附柱平衡后應(yīng)立即使用，長時(shí)間放置會(huì)影響其吸附效果。02注意：洗脫Buffer預(yù)熱后效果更好；可以根據(jù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)、宿主菌等因素調(diào)整洗脫Buffer的添加量。13離心后將EP管內(nèi)的液體重新滴加至吸附柱膜上，12000rpm離心1min；14做好標(biāo)記，取2μl質(zhì)粒跑1%瓊脂糖凝膠電泳檢測驗(yàn)證；15提取出的質(zhì)粒-20℃保存。抽提質(zhì)粒中的常見問題1

提不出質(zhì)?；蛘哔|(zhì)粒提取量很少(1)

菌體中無質(zhì)粒：有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。例如柯斯質(zhì)粒在大腸桿菌中保存不穩(wěn)定，因此不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時(shí)應(yīng)接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。(2)

質(zhì)?？截悢?shù)低：由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體。(3)

菌種老化：若是甘油保藏菌，需要在活化后再培養(yǎng)搖菌；建議涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)。(4)

吸附柱過載：不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請分多次提取。若用富集培養(yǎng)基，例如TB或者2×YT，菌液體積必須減少；若質(zhì)粒或宿主菌是非常高的拷貝數(shù)或生長率，則需調(diào)整LB培養(yǎng)液體積。(5)

堿裂解不充分：使用過多的菌體培養(yǎng)液，會(huì)導(dǎo)致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的用量。對低拷貝數(shù)質(zhì)粒提取時(shí)，可加倍使用溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，有助于增加質(zhì)粒提取量和質(zhì)粒質(zhì)量。(6)

溶液使用不當(dāng)：溶液Ⅱ和Ⅲ在溫度較低時(shí)可能出現(xiàn)渾濁，應(yīng)置于37

℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。(7)

洗脫液加入位置不正確：洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位，以確保洗脫液會(huì)完全覆蓋硅膠。膜的表面，達(dá)到最大洗脫效率。(8)

洗脫液不合適：DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，pH洗脫效率取決于pH值。最大洗脫效率在pH7.0-8.5之間。當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其pH值在此范圍內(nèi)，如果pH過低可能導(dǎo)致洗脫量低。洗脫緩沖液加熱至60℃后使用有利于提高洗脫效率。(9)

洗脫體積太?。合疵擉w積對回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。(10)

洗脫時(shí)間過短：洗脫時(shí)間對回收率也會(huì)有一定的影響。洗脫時(shí)放置1min可達(dá)到較好的效果。(11)

乙醇?xì)埩簦浩匆合礈旌髴?yīng)離心盡量去除殘留液體，樹脂型試劑盒漂洗后應(yīng)晾干樹脂，再加入洗脫緩沖液。(12)

質(zhì)粒未全部溶解：洗脫溶解質(zhì)粒時(shí)，可適當(dāng)加溫或延長溶解時(shí)間。2

質(zhì)粒純度不高(1)

混有蛋白質(zhì)：不要過多使用菌體。溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ處理并離心后，溶液應(yīng)為澄清的，如果還混有微小蛋白質(zhì)懸浮物，可再次離心去除后再進(jìn)行下一步驟。(2)

混有RNA：RNaseA處理不徹底，請減少菌體用量或加入溶液Ⅲ后室溫放置一段時(shí)間。如果溶液Ⅰ已保存6個(gè)月以上，要及時(shí)向Ⅰ中添加RNaseA。(3)

混有基因組DNA：加入溶液Ⅱ、Ⅲ后應(yīng)溫和混勻，若劇烈震蕩，可能把基因組DNA剪切成碎片混在質(zhì)粒中。如果加入溶液Ⅱ后過于黏稠，無法溫和混勻，請減少菌體用量。細(xì)菌培養(yǎng)不要超過16h，時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和DNA的降解。(4)溶液Ⅲ加入時(shí)間過長：溶液Ⅲ加入后，放置時(shí)間不要太長，否則有可能產(chǎn)生小片段DNA污染。(5)

宿主菌含大量核酸酶：宿主菌含大量核酸酶，在質(zhì)粒提取中降解質(zhì)粒DNA，影響提取質(zhì)粒DNA的完整性，最好選用不含核酸酶的大腸桿菌宿主菌，例如DH5α和TOP10。(6)

裂解時(shí)間過長：加入溶液Ⅱ后裂解時(shí)間不宜超過5min。(7)

質(zhì)粒的二聚體和多聚體形式：是質(zhì)粒復(fù)制過程中形成的，與宿主菌相關(guān)，電泳可檢測出。3質(zhì)粒濃度的檢測DNA純度的判斷大多根據(jù)OD260/OD280的比值檢測，符合要求、純度高的DNA樣品其OD260/OD280在1.8-2.0之間，低于此范圍表明蛋白質(zhì)含量超標(biāo)，高于此范圍表明樣品中含有RNA。DNA的純度也可以根據(jù)OD260/OD230的比值判斷，