不同提取方法對綠絨蒿屬植物dna提取效果的影響

不同提取方法對綠絨蒿屬植物dna提取效果的影響

綠色耳艾是薔薇科植物科的一個總稱。該物種于1814年建立，共有49種，分布在東亞和西歐。綠絨蒿屬植物對物種的形成、植物地理區(qū)系和環(huán)境變遷的研究具有重要的價值。從現(xiàn)狀來看,綠絨蒿屬植物的分子生物學研究起步較晚1材料和方法1.1dna提取和生化試劑供試綠絨蒿屬植物為大花綠絨蒿(Meconopsisgrandis)、霍香葉綠絨蒿(Meconopsisbetonicifolia)、綠絨蒿栽培種藍花鈴蔻(Meconopsis‘Lingholm’)。采集新鮮的植物葉片,用硅膠干燥保存?zhèn)溆?。分析純試劑為異丙醇、無水乙醇、異戊醇、三氯甲烷、β-巰基乙醇、CTAB、NaCl;DNA提取試劑盒(天根生化有限公司);植物DNA提取試劑盒(DNeasyPlantMiniKit,德國Qiagen)。1.2測試方法1.2.1研磨葉片研缽手動研磨:研缽里面加入液氮,預冷。研磨材料,加3~5次(約為20~30mg)干燥的植物葉片,充分研磨。電動勻漿馬達研磨器:稱取20~30mg的干燥植物葉片組織,倒入1.5mL離心管中,液氮預冷,加入少許聚乙烯吡咯烷酮(PVP),使用電動勻漿馬達研磨器迅速研磨。1.2.2酶活性的測定改良CTAB法:參照文獻[17]的方法進行,從干燥葉片材料中提取總DNA。向裝有植物葉片研磨成粉末的1.5mL離心管中加入900μL預熱的2%CTAB以及6μL的β-巰基乙醇,充分混勻置于65℃的水浴鍋中45min至2h,期間每隔10min左右搖勻一次。從水浴鍋中取出加入等體積的氯仿異戊醇(24∶1),搖勻,12000r·min1.2.3檢測dna的方法超微量分光光度法:使用Nanodrop2000超微量分光光度計測定DNA樣品在A2結果與分析2.1不同研磨方法的dna提取效果的測定2.1.1用超級分光光度法檢測dna通常將A2.1.2研磨方式的確定由圖1可知,無論采用何種研磨處理方式,研缽手動研磨都要比電動勻漿馬達研磨器研磨的植物葉片提取出來的DNA質量要好,條帶也更加清楚。2.1.3pcr檢測pcr檢測結果將采用2種研磨方式研磨的M.grandis葉片的總DNA各取2μL分別進行PCR檢測,由圖2可知,每個樣品都得到了擴增產(chǎn)物。采用電動勻漿馬達研磨器研磨處理的植物葉片提取的樣品,拖帶比較明顯,研缽手動研磨的植物葉片提取的樣品,得到了較為明顯的擴增條帶。2.2不同提取方法的dna提取效果的檢測2.2.1超微量分光光度測定葉片dna采用改良CTAB法、天根試劑盒法、Qiagen試劑盒法分別提取大花綠絨蒿(M.grandis),霍香葉綠絨蒿(M.betonicifolia),綠絨蒿栽培種藍花鈴蔻(M.‘Lingholm’)葉片的DNA,超微量分光光度檢測結果如表2所示,純DNA的A2.2.2dna質量檢測結果3種方法提取綠絨蒿屬3種植物葉片DNA的凝膠電泳如圖3所示,Qiagen試劑盒法提取的總DNA質量較好,條帶清晰,沒有拖帶現(xiàn)象,與超微量分光光度法檢測結果相符;改良的CTAB法提取的DNA質量居中,條帶清晰明亮,天根試劑盒法提取的總DNA質量相對較差、條帶較弱,拖帶現(xiàn)象比較明顯;改良的CTAB法和天根試劑盒法的點樣孔有不同程度的發(fā)亮,說明提取的DNA樣品中含有部分蛋白質、多糖等,與超微量分光光度法檢測結果相符。2.2.3pcr檢測將不同方法提取的綠絨蒿屬3種植物葉片的總DNA各取2μL分別進行PCR檢測,由圖4可知,3個樣品都得到了擴增產(chǎn)物。用天根試劑盒法提取的樣品中,擴增條帶較弱,而改良的CTAB法和Qiagen試劑盒法均得到了明顯的擴增條帶,擴增條帶質量較好,明亮整齊。3不同研磨方法對于綠絨蒿屬植物dna提取效果的影響植物DNA的提取在植物基因工程以及植物分子生物學研究中占有非常重要的地位利用Nanodrop2000超微量分光光度計測DNA溶液在260、280nm處的光吸收值,記錄A通過Nanodrop2000超微量分光光度計檢測可知,無論采用何種提取方法,研缽手動研磨處理植物葉片提取的DNA純度都要高于電動勻漿馬達研磨器研磨的。在采用同樣的研磨方式處理綠絨蒿屬3種植物葉片的情況下,Qiagen試劑盒法提取的DNA純度最高,均在1.8左右,表明國外試劑盒能夠有效地去除DNA中的各種雜質;改良的CTAB法和天根試劑盒法提取的DNA純度較低,其較高的AQiagen試劑盒法提取的DNA操作簡單、快速,得到的DNA純度比較高,可以直接用于下游的PCR反應,但成本相對于天根試劑盒法和改良的CTAB法要高得多。改良的CTAB法成本較低,但比較費時;天根試劑盒法相較于改良的CTAB法要快速,相較于Qiagen試劑盒法成本較低,但是所得的總DNA得率不高,不能很好地滿足下游PCR的反應。通過該試驗得到以下結論:1)研缽手動研磨和電