犬心絲蟲(chóng)沃爾巴克氏體的檢測(cè)及基因分型研究

犬心絲蟲(chóng)沃爾巴克氏體的檢測(cè)及基因分型研究

狗體內(nèi)的惡絲蟲(chóng)病是由蚊子傳播的線蟲(chóng)性絲綢蟲(chóng)病，它們可能會(huì)對(duì)你的最終主人家（狗）和野生動(dòng)物（山狗、狼等）產(chǎn)生嚴(yán)重的心肺疾病。除狗和其他野生動(dòng)物也可以用作最終所有者。動(dòng)物的感染病例已出現(xiàn)在除南極洲以外的各大洲,在熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛流行,且流行時(shí)間比溫帶和寒帶長(zhǎng)。由于蚊蟲(chóng)是本病的傳播媒介,特別是在熱帶地區(qū),蚊蟲(chóng)一年四季都很活躍,而海南地處熱帶地區(qū),該病幾乎可全年流行。在我國(guó)的北京、上海、重慶、廣東、福建、浙江、湖北、四川、云南、山東、遼寧、內(nèi)蒙古和深圳等27個(gè)省和直轄市已有犬惡絲蟲(chóng)感染動(dòng)物的報(bào)道沃爾巴克氏體(Wb)是共生于犬惡絲蟲(chóng)體內(nèi)的內(nèi)共生菌,在絲蟲(chóng)發(fā)育的各個(gè)階段均存在,當(dāng)犬惡絲蟲(chóng)死亡后,向機(jī)體釋放出大量的Wb,在心絲蟲(chóng)病治療前減少沃爾巴克的水平有利于減少絲蟲(chóng)引起的不良病理反應(yīng),故Wb為犬惡絲蟲(chóng)的致病機(jī)理以及診療提供了新的研究途徑,開(kāi)發(fā)新的診斷工具來(lái)檢測(cè)Wb是建立更有效的心絲蟲(chóng)診斷、治療和控制不良反應(yīng)的新方法。目前Wb被報(bào)道的基因序列有wsp基因、過(guò)氧化氫酶基因、16SrRNA和沃爾巴克絲狀熱敏感蛋白基因(ftsZ基因)。ftsZ基因在沃爾巴克氏體中調(diào)節(jié)細(xì)菌細(xì)胞分裂,有著保守的和高度分散的序列,可作為細(xì)菌分類(lèi)的基礎(chǔ)本試驗(yàn)基于PCR和凝膠電泳的技術(shù),擴(kuò)增犬心絲蟲(chóng)沃爾巴克氏體ftsZ基因,間接診斷犬的外周血的犬心絲蟲(chóng)感染,旨在探尋心絲蟲(chóng)病早期診斷技術(shù),同時(shí)了解和證實(shí)海南省?？谑腥慕z蟲(chóng)的感染情況和犬心絲蟲(chóng)內(nèi)共生體Wb基因分型情況。1材料和方法1.1試驗(yàn)材料1.1.1試劑1.1.2儀器離心機(jī):上海手術(shù)器械廠生產(chǎn);坩浴鍋;PCR儀;移液槍;紫外分析儀;瓊脂糖水平電泳儀;泡沫低溫箱。1.2浮物的吸附與提取取50μL的血液樣品加入到1.5mL離心管中,再加入150μLPBS使總體積為200μL,混勻。加入20μLProteinaseK,混勻。再加入200μL的BufferCL,震蕩混勻,56℃水浴10min。向上述離心管中加入200μL的無(wú)水乙醇,充分顛倒混勻。將吸附柱放入收集管中,用移液器將溶液和半透明纖維狀懸浮物全部加入吸附柱中,靜置2min,再10000r/min(室溫)離心1min,倒掉收集管中廢液。將吸附柱放回收集管中,向吸附柱中加入500μLCW1Solution,10000r/min離心30s,倒掉廢液。將吸附柱放回收集管中,向吸附柱中加入500μLCW2Solution,10000r/min離心30s倒掉廢液。將吸附柱重新放回收集管中,于12000r/min(室溫)離心2min,離心去除殘留的CW2Solution。將吸附柱蓋子打開(kāi)于室溫放置5min。取出吸附柱,加入一個(gè)新的1.5mL離心管中,加入50μLddH1.3rtsz基因采用PCR擴(kuò)增犬心絲蟲(chóng)沃爾巴克絲狀熱敏感蛋白基因(ftsZ基因),片段520~580bp,擴(kuò)增引物參照國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的序列引物1.4同源性分析:ftsz-bis項(xiàng)PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序,登錄美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)站點(diǎn)后,利用“BlastSequenceSimilaritySearching”工具,將測(cè)序結(jié)果與GenBank中注冊(cè)的ftsZ基因相關(guān)核苷酸序列(見(jiàn)表1)進(jìn)行同源性比較。用MEGA3.1軟件neighborjoining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。2結(jié)果2.1基因擴(kuò)增和序列研究的結(jié)果共檢測(cè)犬血60份,犬心絲蟲(chóng)沃爾巴克氏體陽(yáng)性3份,陽(yáng)性率5.0%。測(cè)序結(jié)果目的片段長(zhǎng)度為544~560bp。電泳圖見(jiàn)圖1。2.2系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的聚合體系將犬心絲蟲(chóng)沃爾巴克氏體ftsZ基因序列與GenBank中注冊(cè)的核苷酸序列進(jìn)行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn),本次調(diào)查犬感染的犬心絲蟲(chóng)沃爾巴克氏體(Hainan1hao)與GenBank中注冊(cè)的犬心絲蟲(chóng)沃爾巴克氏體(AY523519.1)的同源性最高。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)也顯示海南省犬感染的心絲蟲(chóng)沃爾巴克氏體與成都的犬感染的心絲蟲(chóng)沃爾巴克氏體聚在一個(gè)分支上,而Dirofilariarepens、Dipetalonemagracile、Onchocercaochengi等都聚在外圍,見(jiàn)圖2。序列分析表明,本次調(diào)查的海南省?？谑腥腥镜奈譅柊涂耸象w均屬于D.immitis基因型而它們之間又并不是完全相同,在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上雖然聚在一個(gè)大的分支上,但在大分支上又有小的分支,而且遺傳距離各不相同。Hainan1hao和成都發(fā)現(xiàn)的chengdu1hao基因型最近,而hainan3hao與成都的基因型最遠(yuǎn),并且hainan1hao與hainan3hao的基因型差距也較遠(yuǎn)。3試驗(yàn)樣本的發(fā)現(xiàn)和分組我國(guó)的犬心絲蟲(chóng)調(diào)查工作開(kāi)展較早,在我國(guó)的北京、上海、深圳、貴州、重慶、廣東、福建、浙江、湖南、四川、云南、山東、遼寧、內(nèi)蒙古和吉林等27個(gè)省和直轄市已有犬惡絲蟲(chóng)感染動(dòng)物的報(bào)道。但在海南開(kāi)展相關(guān)的工作卻較晚,2014年,賈麗欣首次用商品化的愛(ài)得士商品化膠體金免疫診斷試劑盒檢測(cè)到了海南8只犬感染了心絲蟲(chóng)病而PCR的檢測(cè)方法具有較高的靈敏性和特異性,在該病的診斷上具有良好的應(yīng)用前景。沃爾巴克氏體是共生于犬惡絲蟲(chóng)體內(nèi)的共生菌,在絲蟲(chóng)發(fā)育的各個(gè)階段均存在,它誘導(dǎo)的免疫病理引起的炎癥反應(yīng)是絲蟲(chóng)感染后致病的主要原因之一本試驗(yàn)在海南?？谑幸约胰疄閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物,在犬類(lèi)全血樣品中檢測(cè)到了犬心絲蟲(chóng)沃爾巴克氏體的沃爾巴克絲狀熱敏感蛋白基因(ftsZ基因)的特異核苷酸片段,從分子生物學(xué)的角度證實(shí)和發(fā)現(xiàn)了?？谑写嬖谌慕z蟲(chóng)沃爾巴克氏體及其基因型,認(rèn)為該地區(qū)為犬心絲蟲(chóng)病的潛在疫源地。并且犬感染心絲蟲(chóng)率高達(dá)5.0%,不僅反映出犬是海南省?？谑腥慕z蟲(chóng)的重要宿主動(dòng)物之一,也說(shuō)明在犬心絲蟲(chóng)疫源地調(diào)查中利用犬作為指示動(dòng)物具有重要的價(jià)值和意義。海南本地犬感染犬心絲蟲(chóng)沃爾巴克氏體雖然都屬于D.immitis基因型,但它們?cè)谙到y(tǒng)發(fā)育樹(shù)矩形框的距離之間仍存在著一定差異,反映了海南省?？谑蠨.immitis型沃爾巴克氏體基因的多樣性較高。而我們本次試驗(yàn)采用的試驗(yàn)樣本均來(lái)自小動(dòng)物流浪狗中心和寵物醫(yī)院,說(shuō)明這些試驗(yàn)樣本極有可能受到比較復(fù)雜的環(huán)境因素影響,但是這是否確實(shí)與復(fù)雜的地理和氣候環(huán)境、宿主動(dòng)物等因素有關(guān),或者它們?nèi)绾问苡绊懙?還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。相對(duì)而言,它們與我國(guó)四川發(fā)現(xiàn)的D.immitis型較為接近。在進(jìn)化樹(shù)中,遺傳距離與地理分布間無(wú)明顯規(guī)律,可能由于沃爾巴克氏體的基因型比較復(fù)雜,媒介、宿主比較多樣,地理分布與基因型之間的關(guān)系需在今后的研究中繼續(xù)探索。這些分子生物學(xué)的技術(shù),可以對(duì)心絲蟲(chóng)的早期感染進(jìn)行診斷。而且,雖然大多數(shù)物種中都存在沃爾巴克氏體,但是隨著不斷進(jìn)化,寄主