犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及凍存的方法

犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及凍存的方法

0細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞的功能除了骨髓中的骨髓干，還有骨髓間充質(zhì)干，也被稱為骨髓基質(zhì)干。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞,在不同理化環(huán)境和細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下,可向成骨、成軟骨、脂肪和纖維細(xì)胞系等多方向分化,因此,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞愈來愈被細(xì)胞和基因治療學(xué)家看好,成為干細(xì)胞研究的熱點近年來,利用組織工程方法再造具有生理功能的骨組織,用以對缺損組織進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的重建并達(dá)到永久性替代,成為骨缺損修復(fù)的新途徑。組織工程的核心是用少量的細(xì)胞,經(jīng)體外培養(yǎng)大量擴(kuò)增后,與生物材料復(fù)合,構(gòu)建具有生物活性的骨組織來修復(fù)缺損本實驗旨在探索犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)、純化、增殖、凍存的最佳條件及探討其生物學(xué)特性,為進(jìn)一步將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于臨床提供實驗依據(jù)。1來源1:浙江高等教育互聯(lián)網(wǎng)近代研究組即比20d設(shè)計:對照觀察細(xì)胞學(xué)實驗。時間及地點:實驗于2005-06/2008-06在浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨傷研究所完成。材料:健康成年雄性Beagle犬,10kg左右,由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。實驗過程中對動物處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。方法離心液的制備用3%戊巴比妥鈉1mL/kg靜脈注射麻醉后,固定于手術(shù)臺上,備皮、常規(guī)消毒、鋪巾,用26號骨髓穿刺針刺入后肢股骨大粗隆內(nèi),接20mL注射器,內(nèi)含肝素鈉0.8mL(3000U/mL),抽取骨髓8mL,沿離心管壁緩慢疊加到預(yù)先準(zhǔn)備好的4mL淋巴細(xì)胞分離液的2個離心管中,3000r/min,離心30min。緩慢吸取中間界面乳白色云霧狀單個核細(xì)胞層,PBS洗2次,加入含體積分?jǐn)?shù)為0.10胎牛的DMEM培養(yǎng)基完全培養(yǎng),以1×10胎牛血清dmem的傳代培養(yǎng)原代細(xì)胞接近80%~90%融合時,用0.25%胰蛋白酶1mmolEDTA1.0~2.0mL消化2min,待細(xì)胞形態(tài)開始皺縮、細(xì)胞間隙開始增大時,用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液1.5~2mL終止消化,并加入3~5mLPBS,用吸管輕輕吹打,使細(xì)胞充分脫離培養(yǎng)瓶壁,移入離心管,1000r/min,離心3min,棄上清,沉淀加入含體積分?jǐn)?shù)為0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,按1∶2比例傳代培養(yǎng)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長曲線如下取P1、P3、P5代細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10通過測量骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的附著率取第2代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,制備成單細(xì)胞懸液,以5×10利用細(xì)胞活力計算取1~5代傳代細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,以0.4%椎蟲藍(lán)作為染色劑,用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞,共3次,取3次平均值,計算細(xì)胞活力:活細(xì)胞率(%)=活細(xì)胞數(shù)/(總細(xì)胞數(shù)—著色細(xì)胞數(shù))×100%。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的冷凍和恢復(fù)取第2代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,經(jīng)消化后,離心,收集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為6×102結(jié)果2.1胞小集落的細(xì)胞骨髓經(jīng)密度梯度離心后,獲得界面單個核細(xì)胞層,培養(yǎng)72h,換液棄去未貼壁細(xì)胞后,所留的貼壁細(xì)胞即骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,數(shù)量較少,散在分布,呈短梭形形態(tài)。培養(yǎng)1周時細(xì)胞形成大量的小集落,細(xì)胞變長,見圖1。此后集落細(xì)胞迅速增多,逐漸匯合成片,形態(tài)為均一的長梭形,呈旋渦狀排列,見圖2。10d時細(xì)胞長成單層。2.2梭形、增殖剛傳代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞呈圓形,數(shù)小時后迅速貼壁,重新成為梭形。之后細(xì)胞呈長梭形均勻分布生長,形態(tài)比原代培養(yǎng)更均一,細(xì)胞生長旺盛、增殖迅速。連續(xù)傳代10代無明顯變化。但隨傳代次數(shù)增多,細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)多樣性,逐漸呈老化現(xiàn)象。2.3細(xì)胞增殖加速進(jìn)入麻黃生長骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長曲線呈S形,接種后第1、2天為潛伏期。從第3天開始細(xì)胞增殖加速進(jìn)入對數(shù)生長期。第6、7天達(dá)到高峰進(jìn)入平臺期,見圖3。2.4傳代細(xì)胞貼壁情況第2代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的貼壁率見圖4,表明傳代細(xì)胞貼壁較快,2h貼壁率30%以上,4h貼壁60%以上,12h約90%的細(xì)胞貼壁。2.5骨髓間充質(zhì)干燥細(xì)胞的活力第1.3代2.6骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞提示保存犬骨髓骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞需使用液氮保存,短期也可用-80℃冰箱保存。這對擇期進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞研究或移植手術(shù)具重要意義。復(fù)蘇后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞再培養(yǎng),細(xì)胞形態(tài)及生長狀態(tài)與凍存前無差異,均呈長梭形均勻分布生長,細(xì)胞生長增殖旺盛。3骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力的檢測本實驗采用密度梯度分離法和貼壁篩選法相結(jié)合,首先通過密度梯度離心,除去絕大多數(shù)紅細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及白細(xì)胞等細(xì)胞。又利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的貼壁特性,用培養(yǎng)瓶培養(yǎng)作進(jìn)一步純化,經(jīng)過多次換液除去造血細(xì)胞等非貼壁細(xì)胞,獲得較為均一的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。陳歡意等本實驗表明,在生長過程中,犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞同樣經(jīng)歷潛伏期、對數(shù)增殖期和平臺期,生長曲線呈S形,符合正常細(xì)胞的生長特性,而且骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能在短時間內(nèi)貼壁,表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長旺盛,可在體外快速大量增殖,連續(xù)10代的傳代,該骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞仍能保持旺盛的生長和增殖能力。生長曲線及細(xì)胞活力測定顯示1~3代傳代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖快,細(xì)胞活力旺盛、貼壁快,第4代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞活力開始下降,因此骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于細(xì)胞移植時以1~3代細(xì)胞比較合適。付松,張元和等超低溫保存是儲存種子細(xì)胞的重要方法,目前認(rèn)為:凍存效果主要與降溫復(fù)溫速率、凍存劑種類和濃度、凍存前細(xì)胞活力和功能等方面有關(guān)本實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)過液氮長期凍存后,該骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長增殖活性與凍前無差異,這對擇期進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞研究及移植手術(shù)具重要意義。雖然骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具強(qiáng)大的增殖潛能,但本實驗發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在傳代12代后,細(xì)胞逐漸出現(xiàn)老化趨勢,即增殖減慢,細(xì)胞形態(tài)逐漸出現(xiàn)多樣性,貼壁能力減弱。因此在進(jìn)行移植實驗時盡量采用較低代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。如何使其延緩老化,需進(jìn)一步研究和探索。綜上所述,本實驗所獲得的犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長旺盛、增殖能力強(qiáng),其分離、培養(yǎng)、純化、增殖、凍存方法是可行的,可較長時間穩(wěn)定地培養(yǎng)增殖、凍存,傳代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可保持其原代的生物學(xué)特性。本實驗為其在組織工程中的應(yīng)用提供了一定的實驗依據(jù)。主要觀察指標(biāo)復(fù)蘇前后細(xì)胞生長活性及形態(tài)變化。符合我國國際動物中心動物中心的研究實驗的設(shè)計及評估為第一、五作者,實施由第二、三、四作者完成,所有人員均接受過浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心動物實驗上崗培訓(xùn)。細(xì)胞成活率大致相同約為96%。第四部分成活率下降,約為92%。第五代細(xì)胞活力明顯下降,