熒光定量pcr中熒光探針的研究進(jìn)展

熒光定量pcr中熒光探針的研究進(jìn)展

牛仔布斯特（pcr）是美國科學(xué)家在1983年開發(fā)的一種快速擴(kuò)展的特定基因。它也是一種方法。進(jìn)展最快、應(yīng)用最廣泛、簡單的外部基因復(fù)制技術(shù)。PCR通過重復(fù)模板鏈變性,引物退火,聚合酶延伸3個步驟,對目的基因或基因片段進(jìn)行擴(kuò)增,理論上目的基因數(shù)量在每個溫度循環(huán)后將增加1倍,經(jīng)20次～30次循環(huán)后,被擴(kuò)增的基因數(shù)可達(dá)106以上,其敏感性相當(dāng)高,任何痕量樣品都可得到擴(kuò)增,因此被廣泛應(yīng)用于臨床病原微生物的診斷領(lǐng)域。但由于其高度靈敏,在擴(kuò)增時細(xì)微的條件變化都將影響擴(kuò)增量和特異性,且任何DNA樣品或所用試劑均有可能發(fā)生交叉污染,因此常規(guī)PCR在用于病原微生物診斷檢測時存在不能準(zhǔn)確定量,易交叉污染產(chǎn)生假陽性等局限。近年來將熒光共振能量傳遞技術(shù)應(yīng)用于PCR,不僅提高了PCR的特異性,而且還能做到實時準(zhǔn)確定量。當(dāng)一個受激發(fā)的熒光素(供體)的能量轉(zhuǎn)移到鄰近的另一熒光素(受體),并不發(fā)射熒光而是受淬滅回到基態(tài),這一現(xiàn)象就稱為熒光共振能量傳遞(fluorescentresonanceenergytransfer,FRET)。熒光能量轉(zhuǎn)移效率與熒光分子和淬滅分子距離的6次方成反比。FRET與PCR結(jié)合用于對PCR產(chǎn)物的檢測,不但可能提高檢測的靈敏度,而且還能對PCR產(chǎn)物進(jìn)行準(zhǔn)確定量,提高其檢測的特異性。目前,在獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域熒光定量PCR主要用于動物傳染病病原的定量檢測。1發(fā)展熒光檢測定量pcr技術(shù)1.1熒光淬滅分子檢測TaqMan技術(shù)是PE-ABI公司開發(fā)的熒光定量技術(shù),它利用了Taq酶的5′-3′外切酶活性,合成一個能與PCR產(chǎn)物雜交的探針,該探針的5′末端標(biāo)記一個熒光分子,3′末端標(biāo)記熒光淬滅分子。其中3′端熒光分子能夠吸收5′端熒光分子發(fā)出的熒光,因此正常情況下檢測不到該探針5′端熒光分子發(fā)出的熒光,但當(dāng)溶液中有PCR產(chǎn)物(模板)時,該探針與模板結(jié)合,激活Taq酶的5′-3′外切酶活性,將探針5′端連接的熒光分子從探針上切割下來,加大了與淬滅分子的空間距離,擺脫了淬滅分子的熒光淬滅作用而發(fā)出熒光(圖1),切割的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成比例。因此,根據(jù)PCR反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度即可計算出初始模板的數(shù)量。1.2淬滅探針反應(yīng)Amplisensor探針是一種復(fù)合探針技術(shù),互補(bǔ)的兩探針,一探針5′末端連接一種熒光分子,另一探針3′末端連接淬滅分子。兩探針長度不同,其中淬滅探針的5′末端多出7個堿基(GCGTCCC)。PCR擴(kuò)增前需用連接酶將熒光探針與PCR半套式引物連接,半套式引物的5′末端應(yīng)有一段與長探針互補(bǔ)的序列,以便連接酶將引物與探針連接。PCR擴(kuò)增時探針一引物復(fù)合物中的代引物部分作為半套式引物優(yōu)先參入到模板,從而釋放出淬滅探針,破壞了FRET,熒光探針從而產(chǎn)生熒光,熒光的強(qiáng)度與擴(kuò)增時加入的模板數(shù)成正比(圖2)。可直接將半套式引物合成在熒光探針的3′端,省去了PCR擴(kuò)增前的連接步驟。1.3探針與模板的雜交分子信標(biāo)技術(shù)(molecularbeacon,MB)是一種設(shè)計巧妙的熒光探針,與TaqMan和Amplisensor探針不同,該探針5′末端和3′末端自身可形成8個堿基左右的發(fā)夾式結(jié)構(gòu)使熒光分子和淬滅分子鄰近而發(fā)生熒光淬滅,球環(huán)是特異的探針部分。當(dāng)溶液中有特異模板時該探針與模板雜交,由于分子的剛性破壞了探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu),即破壞了FRET,于是溶液便產(chǎn)生熒光(圖3),熒光的強(qiáng)度與溶液中探針的雜交量(即模板量)成正比。后來,NazarenkoIA等在分子信標(biāo)的發(fā)夾堿基末端直接連接上PCR引物,設(shè)計出一種發(fā)夾探針式引物(sunriseprimer),因此使所有的擴(kuò)增產(chǎn)物均能標(biāo)記上熒光分子,熒光信號響應(yīng)快(圖4)。WhitcombeD等在Nazarenko的基礎(chǔ)上對發(fā)夾探針式引物進(jìn)行了改進(jìn),發(fā)明了一種稱之為蝎狀引物(scorpionprimer)的熒光定量PCR技術(shù),他在引物與分子信標(biāo)探針之間連接一個間隔阻斷臂,使PCR延伸反應(yīng)時不能夠延伸至信標(biāo)分子,因此非特異擴(kuò)增產(chǎn)物便無熒光信號,但當(dāng)有特異擴(kuò)增產(chǎn)物時分子信標(biāo)即可與擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分子內(nèi)雜交,產(chǎn)生熒光信號(圖5)。1.4熒光分子和淬滅分子的fret反應(yīng)LightCycler是Roche公司開發(fā)的一種PCR定量技術(shù),該技術(shù)是將熒光分子和淬滅分子分別標(biāo)記在兩個不同探針上,產(chǎn)生發(fā)光探針和淬滅探針,發(fā)光探針的5′末端連接熒光分子;淬滅探針的3′末端連接熒光分子。由于兩探針設(shè)計時可與模板同一條鏈相鄰的序列雜交,雜交時兩探針的熒光分子和淬滅分子便緊密相鄰,從而發(fā)生FRET,使熒光淬滅(圖6)。熒光淬滅的程度與起始模板的量成反比,以此可以進(jìn)行PCR定量分析。1.5子信標(biāo)熒光探針復(fù)合探針的結(jié)構(gòu)復(fù)合探針(complexprobes)定量PCR技術(shù)是我國研究和開發(fā)的一種新型定量PCR技術(shù),這種定量PCR技術(shù)綜合了lightcyler技術(shù)和分子信標(biāo)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),同時又克服了它們的不足之處。該復(fù)合探針由一條長的熒光雜交探針和短的淬滅探針構(gòu)成,其中熒光探針5′末端接一熒光分子,3′末端接一延伸阻斷分子磷酸,淬滅探針3′末端連接一個淬滅分子對甲基紅,淬滅探針與熒光探針5′端互補(bǔ),無模板時,該探針雜交形成復(fù)合探針,無熒光產(chǎn)生。當(dāng)擴(kuò)增過程中有靶基因時,在較高溫度下熒光探針優(yōu)先與模板結(jié)合,從而使兩探針分離并產(chǎn)生熒光(圖7),熒光強(qiáng)度與PCR體系中模板數(shù)量成正比,因此可對PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測。1.6探針的熒光淬滅作用原理孔德明等綜合分子信標(biāo)及TaqMan探針技術(shù),設(shè)計了一種新型的均相熒光檢測探針(TaqMan-MB)。該探針保留了分子信標(biāo)的莖-環(huán)結(jié)構(gòu),從而保證了熒光分子與淬滅分子的熒光淬滅距離,當(dāng)無靶序列時能有效地發(fā)揮熒光淬滅作用。但與常規(guī)分子信標(biāo)不同的是,除球環(huán)部序列外,其5′端的堿基臂序列也設(shè)計為探針的基因識別部位。在PCR擴(kuò)增的退火/延伸階段,探針與模板上相應(yīng)的靶基因位點(diǎn)特異性結(jié)合。同時,Taq酶隨著引物的延伸沿DNA模板移動,當(dāng)移到探針結(jié)合位置時,發(fā)揮其5′-3′外切酶活性,將探針切斷,從而使熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)徹底遠(yuǎn)離,熒光基團(tuán)熒光復(fù)原。體系熒光信號自于探針與靶基因雜交時所引起的構(gòu)象變化和探針的降解(圖8),大大地增強(qiáng)了體系的熒光強(qiáng)度。2熒光定量pcr檢測相對于人的疾病定量檢測,熒光定量PCR技術(shù)用于動物傳染病病原的定量檢測步伐要慢得多,這并不是技術(shù)本身在檢測動物疾病受到限制,而相對于人來說,動物本身的價值與技術(shù)成本存在一定的差距。但隨熒光定量PCR技術(shù)的成熟和發(fā)展,對許多難培養(yǎng)或不能培養(yǎng)的動物傳染病病原用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行診斷就簡單易行,許多人畜共患傳染病對人畜危害特別大,可用此技術(shù)。還有一般技術(shù)對疾病亞臨床或潛伏感染的診斷顯得無能為力,用熒光定量PCR技術(shù)對這些病進(jìn)行診斷具有其獨(dú)特的優(yōu)勢。目前,運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)診斷動物傳染病病原的報道也日漸增多。ThieryR等建立了檢測PRV急性和潛伏感染豬三叉神經(jīng)節(jié)中DNA的熒光定量PCR方法,其靈敏度達(dá)到5個PRV基因組拷貝數(shù)/106宿主細(xì)胞,且更適合于診斷低感染量的潛伏感染豬的PRV,比其他方法更加敏感、特異。BumsteadN等用熒光定量PCR檢測雞馬立克氏病病毒,即可檢測到組織樣品中MDV的存在,而且可準(zhǔn)確定量,比蝕斑測定省時省力。我國雖然有世界最好的豬瘟弱毒疫苗,但豬瘟仍然是我國豬病中的罪魁禍?zhǔn)?給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。常規(guī)方法很難區(qū)別隱性感染豬、帶毒豬和弱毒免疫豬。陳玉棟等建立一種快速定量檢測豬瘟兔化弱毒苗的熒光定量PCR技術(shù),在豬瘟兔化弱毒疫苗株的5′端非編碼區(qū)設(shè)計一對引物和一條熒光探針,利用LightCycler檢測系統(tǒng),首次建立了定量檢測豬瘟兔化弱毒疫苗的方法。結(jié)果表明,該方法的靈敏度為100拷貝數(shù),與兔體定型熱反應(yīng)有很好的相關(guān)性,整個檢測過程僅需4h。該法可望取代傳統(tǒng)的兔體定型熱反應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)過程中的效價測定及指導(dǎo)疫苗的配制,也為豬瘟病毒分子生物學(xué)研究提供了一種新的、簡捷有效的工具。鴨乙型肝炎病毒是造成鴨發(fā)病的重要病原之一,與人乙型肝炎病毒有許多相似點(diǎn)。陳壓西等建立了鴨乙型肝炎病毒核酸熒光定量PCR方法,并用于鴨血清中病毒核酸的定量檢測,取得很好效果。通過檢測血清中肝炎病毒核酸的含量,可以分析病毒在體內(nèi)的復(fù)制活動情況,從而為研究病毒性肝炎的發(fā)病機(jī)理,評價和預(yù)測抗病毒藥物的療效提供重要依據(jù)。雞傳染性法氏囊病病毒,豬腸道病毒等動物的其他病毒的熒光定量PCR檢測也已報道。用熒光定量PCR檢測對人畜危害大,而且培養(yǎng)困難的細(xì)菌,是此技術(shù)的又一大優(yōu)勢。彎曲菌被認(rèn)為是人類主要食源性病原之一。由于空腸彎曲菌特殊的生長條件和容易進(jìn)入不可培養(yǎng)但存活的狀態(tài),所以傳統(tǒng)的生化鑒定結(jié)果并不一定可靠,并且是一項費(fèi)時而繁瑣的工作。陽成波等建立了一種基于TaqMan探針的實時定量PCR方法來定量檢測空腸彎曲菌。該方法可在60min內(nèi)完成,檢測限度為5cfu。這種熒光定量PCR方法既為空腸彎曲菌提供了一種特異、敏感、快速和簡潔的定量檢測方法,又為研究空腸彎曲菌致病機(jī)理提供了一種重要的方法。引起萊姆病的伯氏疏螺旋體和引起各種動物發(fā)病的支原體都是不易在體外培養(yǎng)的細(xì)菌,熒光定量PCR可對這類細(xì)菌進(jìn)行定量檢測。StraubingerRK等設(shè)計與伯氏疏螺旋體特異性ospA基因片段互補(bǔ)的引物和熒光探針,用熒光定量PCR技術(shù)檢測了從小獵兔犬皮膚提取的活組織樣和血液樣品中的伯氏疏螺旋體的特異性ospA基因。實時監(jiān)測了小獵兔犬感染伯氏疏螺體后500d內(nèi)從皮膚提取活組織的樣品和血液樣品中的螺旋體數(shù)量變化情況,并比較了抗生素治療和未治療對組織中病原體基因含量的影響。熒光定量PCR還可用于對伯氏疏螺旋體在野外蜱中的流行病學(xué)調(diào)查。雞毒支原體、流產(chǎn)布魯氏菌和炭疽桿菌等細(xì)菌的熒光定量PCR也已見報道。熒光定量PCR已用于寄生蟲的檢測和鑒別,PremanandhJ等用熒光定量PCR檢測了馬生殖泰勒蟲,并用此法區(qū)別驢生殖道泰勒蟲。熒光定量PCR在對有些寄生蟲病的診斷和鑒別中顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢。3其