分子病理學(xué)常用研究方法-課件

分子病理學(xué)常用研究方法

(一)1分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件分子病理學(xué)常用研究方法1分子病理學(xué)常用研究方法ppt基因變異的診斷

2分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件基因變異的診斷2分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件Southernblot,

PCR,

RT-PCR,Real-TimeRT-PCR,

FISH分子遺傳學(xué)異常檢測(cè)方法3分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件Southernblot,分子遺傳學(xué)異常檢測(cè)方法3檢測(cè)基因的丟失和擴(kuò)增

比較基因組雜交ComparativeGenomicHybridization,CGH分子生物學(xué)技術(shù)與細(xì)胞遺傳學(xué)方法相結(jié)合優(yōu)點(diǎn)：1.新鮮材料和福爾馬林固定石蠟包埋材料均可進(jìn)行CGH研究2.被測(cè)樣品只需數(shù)mg甚至不到1mg的DNA4分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件檢測(cè)基因的丟失和擴(kuò)增4分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件5分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件5分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件CGH的應(yīng)用：為搜尋腫瘤的癌基因或抑癌基因確定范圍腫瘤細(xì)胞染色體某一位置上DNA序列拷貝數(shù)增加，往往提示該位置可能包含已知或未知的癌基因有擴(kuò)增腫瘤細(xì)胞染色體某一位置上DNA序列拷貝數(shù)減少或缺失，提示該位置可能包含已知或未知的抑癌基因丟失CGH發(fā)現(xiàn)MYCN，MET與胃癌相關(guān)6分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件CGH的應(yīng)用：6分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件區(qū)分良惡性病變，臨床上估計(jì)預(yù)后

16例前列腺癌CGH顯示染色體異常占81%5例良性前列腺增生全部陰性

67肝細(xì)胞癌CGH顯示:1q,8q,20q,17q↑4q,8p,13q,16q↓12例癌周肝硬化組織：陰性

53例淋巴結(jié)陰性乳腺癌：8q,11q13,17q,20q異常，預(yù)后差

7分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件區(qū)分良惡性病變，臨床上估計(jì)預(yù)后7分子病理學(xué)常用研究方法p蛋白組學(xué)及生物芯片8分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件蛋白組學(xué)及生物芯片8分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件生物芯片（biochip)是指采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法將大量核酸片段（寡核苷酸、cDNA、基因組DNA、RNA）或多肽分子甚至細(xì)胞等生物樣品有序地固定于支持物（玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝膠、尼龍膜等載體）的表面，組成密集的二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測(cè)生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器如激光共聚焦掃描或電荷偶聯(lián)攝影像機(jī)（CCD）對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測(cè)分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量改變。

9分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件生物芯片（biochip)9分子病理學(xué)常用研究方法ppt生物芯片：基因芯片蛋白質(zhì)芯片細(xì)胞芯片組織芯片基因芯片(Affymetrix專利）

寡核苷酸芯片，cDNA芯片，基因組芯片

DNAmicroarray:陣密度很高的玻片基質(zhì)或膠膜基質(zhì)的DNA微陣列DNAmacroarray:陣密度較低的尼龍膜DNA微陣列

10分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件生物芯片：10分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件雜交組織化學(xué)-概述一、概述和原理

雜交組織/細(xì)胞化學(xué)(Hybridohistochemistry)

原位分子雜交(Insituhybridization,ISH)運(yùn)用核酸分子間鹼基互補(bǔ)的性質(zhì)結(jié)合免疫組織化學(xué)技術(shù)在組織切片(或細(xì)胞片)上顯示特異核酸(DNA或RNA)序列的一種技術(shù)。11分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件雜交組織化學(xué)-概述一、概述和原理11分子病理學(xué)常用研究方法雜交組織化學(xué)原理標(biāo)記探針雜交變性標(biāo)記探針

──

互補(bǔ)核酸順序DNA/cDNADNADNA/cDNARNARNARNA12分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件雜交組織化學(xué)原理標(biāo)記探針雜交變性標(biāo)記探針──互核酸分子雜交種類：固相雜交(硝酸纖維素膜或尼龍膜)Southern印跡轉(zhuǎn)移(DNA)Northern印跡轉(zhuǎn)移(RNA)

液相雜交原位雜交原位雜交四要素：

適當(dāng)?shù)奶结樍己玫慕M織材料可靠的試劑和方法相當(dāng)?shù)男螒B(tài)學(xué)基礎(chǔ)13分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件核酸分子雜交種類：固相雜交(硝酸纖維素膜或尼龍膜)13分子二、探針的制備1.探針的種類和制備

DNA探針：應(yīng)用多，操作容易比較敏感，背景高(自身網(wǎng)絡(luò))雙鏈DNA探針用時(shí)要變性

整合

轉(zhuǎn)化擴(kuò)增DNA片段───質(zhì)粒(或其他載體)───細(xì)菌───

提取酶切───質(zhì)粒───探針(PCR擴(kuò)增)14分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件二、探針的制備14分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件線性質(zhì)粒提取質(zhì)粒擴(kuò)增探針重組質(zhì)粒質(zhì)粒酶切插入轉(zhuǎn)染探針15分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件線性質(zhì)粒擴(kuò)增探針重組質(zhì)粒質(zhì)粒酶切插入轉(zhuǎn)染RNA探針：結(jié)合穩(wěn)定，穿透性好無需變性，不存在退火問題未雜交探針可用RNase去除，背景好多采用體外轉(zhuǎn)錄法合成同時(shí)加以標(biāo)記

寡核苷酸探針：合成快速，不用變性，對(duì)RNase不敏感30-150bp，組織通透性好未端標(biāo)記，敏感度不夠多采用DNA合成儀固相合成16分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件RNA探針：結(jié)合穩(wěn)定，穿透性好16分子病理學(xué)常用研究方法探針的選擇:特異性多選擇基因組的5'或3'端20-50對(duì)堿基互補(bǔ)就已穩(wěn)定

大小200-300對(duì)堿基互補(bǔ)可獲強(qiáng)的復(fù)合體原位雜交多選擇100-400bp(<1000bp)種類穩(wěn)定性：RNA-RNA>DNA-RNA>DNA-DNA17分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件探針的選擇:17分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件2.探針的標(biāo)記

標(biāo)記物：同位素,非同位素,修飾物同位素：敏感，定位較差，實(shí)驗(yàn)室要求高

探針使用周期短

32P放射過強(qiáng),定位差,半衰期短(14.3天)

35S最常用,定位好,曝光時(shí)間短(數(shù)天),半衰期較長(84天)

125I與35S相似，但半衰期較短(60天)

3H常用,放射能小,定位準(zhǔn)確,曝光時(shí)間長(數(shù)周),半衰期長18分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件2.探針的標(biāo)記18分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件非同位素：定位較好，實(shí)驗(yàn)室要求低，可長期使用

生物素：最早用，特點(diǎn)與免疫組化相似地高辛：最常用，敏感性高，特異性好熒光素：方法簡(jiǎn)便，敏感性低，多用于染色體檢查

修飾物(現(xiàn)少用)：磺基化(Sulphon基團(tuán))乙酰氨基芴光敏生物素汞19分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件非同位素：定位較好，實(shí)驗(yàn)室要求低，可長期使用19分子病理學(xué)常

標(biāo)記方法

引入法：運(yùn)用標(biāo)記好的核苷酸合成探針缺口翻譯法隨機(jī)引物法末端標(biāo)記法PCR擴(kuò)增標(biāo)記法RNA體外合成法化學(xué)修飾法：化學(xué)修飾已合成的探針20分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件標(biāo)記方法20分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件缺口翻譯/平移法：雙鏈DNA標(biāo)記，線環(huán)狀均可分子較大(>1KB)者效果好DNA用量較多(>200ng)標(biāo)記率低原理：DNA酶(DNaseI)在雙鏈DNA分子中導(dǎo)入缺口DNA聚合酶(DNApolI，具有5'→3'外切酶和5'→3'聚合酶活性)，使各種核苷酸，包括標(biāo)記核苷酸自缺口處合成與對(duì)應(yīng)鏈互補(bǔ)的DNA鏈(探針)變性后標(biāo)記探針分子小，穿透性好21分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件缺口翻譯/平移法：雙鏈DNA標(biāo)記，線環(huán)狀均可21分子病理學(xué)常缺口翻譯/平移法22分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件缺口翻譯/平移法22分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件隨機(jī)引物法：?jiǎn)?雙鏈線狀DNA標(biāo)記，100-500bp亦可DNA用量少(可少至10ng)標(biāo)記率高(1/20-25)原理：以任意順序的六核苷酸片段為引物與單鏈DNA模板結(jié)合后，在DNA聚合酶I的Klenow片段(無5'-3'外切酶活性)作用下合成帶標(biāo)記核苷酸的互補(bǔ)DNA鏈(探針)23分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件隨機(jī)引物法：?jiǎn)?雙鏈線狀DNA標(biāo)記，100-500bp亦可2隨機(jī)引物法24分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件隨機(jī)引物法24分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件1.于Eppendorf離心管中依次加入15μlddH2O1μgDNA(10ng-3μg)100℃10'(變性)干冰聚冷30秒鐘2.加入10×六核苷酸混合物2μl10×dTNP標(biāo)記混合液2μl

含1mMdATP，1mMdCTP，1mMdGTP，0.65mMdTTP，0.35mMDIG-dUTPKlenow酶(2U/μl)1μl

25分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件1.于Eppendorf離心管中依次加入25分子病理學(xué)常用3.混合后37℃保溫1-2h(可達(dá)20h)4.加入2μlpH8.0200mMEDTA終止反應(yīng)5.加入2μl糖原(10mg/ml)6.加2.5μl4MLiCl或3MNaAc(pH5.5)7.加75μl無水乙醇(-20℃預(yù)冷)8.混合后-70℃30'9.13000g4℃離心15'，棄上清10.加100μl70%乙醇(預(yù)冷)洗，離心棄上清11.真空干燥，加50μlTE(10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)溶解，-20℃保存

26分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件3.混合后37℃保溫1-2h(可達(dá)20h)26分子病理學(xué)常末端標(biāo)記法：用于短鏈DNA或寡核苷酸探針標(biāo)記敏感性較低40個(gè)以上堿基檢測(cè)較穩(wěn)定又分3'端標(biāo)記法和5'端標(biāo)記法3'端標(biāo)記法：原理：DIG-11-ddUTP在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶作用下與寡核苷酸的3'端相連27分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件末端標(biāo)記法：用于短鏈DNA或寡核苷酸探針標(biāo)記27分子病理學(xué)常5'端標(biāo)記法：原理:在堿性磷酸酶的作用下把5‘端磷酸脫去,T4噬菌體多核苷酸激酶將[γ-32P]ATP的γ-32P轉(zhuǎn)移到5'端PCR擴(kuò)增標(biāo)記法：用于cDNA的合成和標(biāo)記，方法簡(jiǎn)單DNA用量少，產(chǎn)量多原理：TaqDNA多聚酶以DNA為模板，在引物引導(dǎo)下合成帶有標(biāo)記核苷酸的cDNA探針。28分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件5'端標(biāo)記法：28分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件PCR擴(kuò)增標(biāo)記法29分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件PCR擴(kuò)增標(biāo)記法29分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件1.于Eppendorf離心管中加入10×PCR緩沖液5μl(1×)MgCl22～10μl(1～5mM)引物適量(0.1～1μM)標(biāo)記/非標(biāo)記dNTP5μl(200μM，dTTP:Dig-dUTP=3:1)

ddH2O加到50μl模板DNA1～100ngTagDNA多聚酶0.2～1μl(1～5units)30分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件1.于Eppendorf離心管中加入30分子病理學(xué)常用研究方反應(yīng)組對(duì)照組1對(duì)照組2DNA模板++-Dig-dUTP+--2．混合后PCR儀擴(kuò)增循環(huán)溫度時(shí)間194°C5’94°C45’

2～3155＋0.2°C45’

72°C90’

3272°C5’

334°CHold31分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件反應(yīng)組對(duì)照組13.純化和鑒定乙醇沉淀法：100μlPCR產(chǎn)物加10μl4MLiCl和300μl預(yù)冷的100%乙醇，-20?C，2小時(shí)，離心4?C13000g，5分鐘Agarose凝膠電泳32分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件3.純化和鑒定32分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件RNA體外合成/標(biāo)記法：用以合成并同時(shí)標(biāo)記RNA探針產(chǎn)量高，NTP濃度要求低，不用純化原理：將模板DNA(雙鏈)插入帶有噬菌體RNApol啟動(dòng)子的特定質(zhì)粒，在體外RNApol作用下，以DNA為模板、啟動(dòng)子為起點(diǎn)，合成帶有標(biāo)記核苷酸的RNA探針。33分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件RNA體外合成/標(biāo)記法：用以合成并同時(shí)標(biāo)記RNA探針33分子雜交組織化學(xué)RNA體外合成/標(biāo)記法pGEM34分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件雜交組織化學(xué)RNA體外合成/標(biāo)記法pGEM34分子病理學(xué)1.

于Eppendorf離心管中加入DNA模板(酶切成線性)1μg

含噬菌體啟動(dòng)子的質(zhì)粒NTP標(biāo)記混合物2μl

含10mMATP，10mMCTP10mMGTP，6.5mMUTP3.5mMDIG-11-UTP10×反應(yīng)緩沖液2μl

DEPC處理的H2O加至17μl35分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件1.

于Eppendorf離心管中加入35分子病理學(xué)常

2.混合后加：RNase抑制劑1μl

RNA多聚酶(SP6/T7)2μl

3.柔和混合后37℃保溫2h

4.加入DNaseⅠ2μl，37℃15'(去除模板DNA)

5.加入2μl200mMpH8.0EDTA

6.加入2.5μl4MLiCl和75μl預(yù)冷乙醇

7.混合后置-70℃，30'或-20℃過夜

8.4℃13000g離心15'，棄上清

9.加100μl70%乙醇(預(yù)冷)洗，離心棄上清10.真空干燥，加100μlDEPC-H2O溶解，-20℃保存

36分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件2.混合后加：RNase抑制劑化學(xué)修飾法：常用的有光敏生物素、磺化可用以標(biāo)記單/雙鏈DNA或RNA光敏生物素標(biāo)記：光敏生物素+核酸────標(biāo)記探針磺化標(biāo)記：亞硫酸氫鈉和甲基羥胺使胞嘧啶的C5磺化，生成Sulphon基團(tuán)。乙酰氨基芴(AAF)標(biāo)記：N-acetoxy-AAF與探針一起孵育時(shí)，AAF基團(tuán)與鳥嘌呤核苷殘基共價(jià)結(jié)合37分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件化學(xué)修飾法：常用的有光敏生物素、磺化37分子病理學(xué)常用研究方3.標(biāo)記探針的純化目的：去除無機(jī)鹽、dNTP、酶等方法：沉淀離心法

加入EDTA中止反應(yīng)，再加4MLiCl和乙醇冷凍離心，乙醇洗滌，干燥后用緩沖液溶解

玻璃纖維濾過法

反應(yīng)物與玻璃纖維結(jié)合，清洗，緩沖液洗脫38分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件3.標(biāo)記探針的純化38分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件4.標(biāo)記結(jié)果的檢驗(yàn)?zāi)康模鹤C實(shí)標(biāo)記結(jié)果；估計(jì)探針得率；測(cè)試檢測(cè)條件非同位素標(biāo)記探針的檢驗(yàn)：采用斑點(diǎn)印跡法不同濃度(10倍梯度稀釋)的標(biāo)記探針點(diǎn)尼龍膜常規(guī)檢測(cè)系統(tǒng)顯色未標(biāo)記探針點(diǎn)膜后用標(biāo)記探針雜交39分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件4.標(biāo)記結(jié)果的檢驗(yàn)39分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件不同濃度（10倍梯度稀釋）的標(biāo)記探針點(diǎn)尼龍膜DNA／RNA探針：0.01pg～1ng／ul寡核苷酸探針：0.08FM～50fM/ul紫外照光或加熱120℃30’固膜緩沖液1洗膜（100mM馬來酸，150mMNaC1，pH7.5）緩沖液2（1%阻斷劑，緩沖液1配）30’抗DIG一堿性磷酸酶1：5000，孵育30’緩沖液1洗膜緩沖液3浸2’(100mMTris-HC1．100mMNaC1，50mMMgC12，pH9.5）顯色液（NBT：BCIP，9:7），作用0.5～16h緩沖液3洗膜40分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件不同濃度（10倍梯度稀釋）的標(biāo)記探針點(diǎn)尼龍膜40分子病理學(xué)常三、組織處理和標(biāo)本制作

目的：保留好被測(cè)核酸維持形態(tài)結(jié)構(gòu)

方法：新鮮取材、及時(shí)固定適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ海?%多聚甲醛(用0.1MPB配制)

用于：冰凍或石蠟切片細(xì)胞培養(yǎng)片、細(xì)胞涂片或切片41分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件三、組織處理和標(biāo)本制作41分子病理學(xué)常用研究方法ppt課DNA穩(wěn)定性好，一般不需特殊處理

RNA酶的滅活(雜交前)：組織內(nèi)的Rnase:固定劑滅活玻璃器皿：180℃處理3h以上用DEPC(二乙基焦碳酸鹽)水處理試劑：用DEPC水配制和/或高壓消毒帶手套操作RNase抑制劑42分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件DNA穩(wěn)定性好，一般不需特殊處理42分子病理學(xué)常用研檢測(cè)RNA時(shí)標(biāo)本制備及玻片處理常規(guī)：

切片處理：切片插架──熱水稀釋的中性洗滌劑浸泡30'──流水沖洗──高壓消毒──流水沖洗──蒸餾水洗──180℃3h──APES處理(2%APES/甲醇）室溫1'，甲醇洗──DEPC水洗──陰干

標(biāo)本處理：4%多聚甲醛(PB配)4℃過夜──乙醇脫水──二甲苯透明──石蠟包埋──切片

DEPC水：0.1DEPC，室溫放置3h，高壓消毒43分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件檢測(cè)RNA時(shí)標(biāo)本制備及玻片處理常規(guī)：43分子病理學(xué)常用研究方四、原位分子雜交

要求：提高敏感性降低非特異著色

方法：去垢劑(TritonX-100)：增強(qiáng)組織通透性

蛋白酶(蛋白酶K)消化：增加通透性、去除雜蛋白

稀酸：雜蛋白變性、去內(nèi)源性酶、暴露靶核酸

乙?；幚恚褐泻完栯x子，減少靜電吸引

適當(dāng)?shù)碾s交條件：溫度、離子強(qiáng)度、pH探針的種類、大小、濃度

雜交液：葡聚糖：增加探針相對(duì)濃度魚精DNA、tRNA的應(yīng)用：封閉

充分洗滌44分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件四、原位分子雜交44分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件1.雜交前處理石蠟切片常規(guī)脫蠟，PB洗片，[TritoX-100]蛋白酶K消化，37℃，(1～15μg/ml，15～120')4%多聚甲醛后固定，室溫10'PB洗片1～2'×2；0.2MHCl，室溫10'；PB洗片1～2'×20.1M三乙醇胺(DEPC-H2O配)，室溫2～3'三乙醇胺/無水乙酸室溫10'PB洗片，室溫2'×270%→80%→90%→100%→100%酒精脫水室溫干燥45分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件1.雜交前處理45分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件2.雜交（預(yù)雜交）滴加雜交工作液，蠟?zāi)どw片，濕盒內(nèi)，50℃16～20h(檢測(cè)DNA時(shí)要求先變性(90~100度)，探針為雙鏈DNA也要變性)

雜交液：甲酰胺50%Tris-HClpH7.610mMDEPC-H2OEDTApH8.01mM加到50.0mlNaCl600mM-70℃保存Denhart's液1×SDS0.25%46分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件2.雜交46分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件50%×Denhart's液：聚蔗糖(Ficoll400)10g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)10g牛血清白蛋白(BSA)10gDEPC-H2O1000ml雜交工作液：1ml雜交液加tRNA(最終濃度0.3～0.5mg/ml)加標(biāo)記探針(最終濃度0.5～5μg/ml)每張切片用50μl47分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件50%×Denhart's液：聚蔗糖(Ficoll400雜交條件的優(yōu)化：

溫度：溫度高反應(yīng)快，溫度太高破壞組織，一般Tm-25℃G:C多者Tm高(G:C50%Tm約為70℃)甲酰胺可降低雜交溫度(1%下降0.35～0.65℃)

探針：長的雜交快(太長時(shí)穿透性差)復(fù)雜性高的雜交時(shí)間長濃度高雜交時(shí)間短離子強(qiáng)度和pH：離子強(qiáng)度高雜交體穩(wěn)定性好（0.01-0.4M)兩價(jià)陽離子可使DNA結(jié)合牢固，用EDTA去除常用50%甲酰胺，pH6.5～7.5，45～65℃，雜交16～20h48分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件雜交條件的優(yōu)化：48分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件3.雜交后處理

洗片：5×SSC，50℃1'去膜；5×SSC，50℃5'2×SSC+50%甲酰胺，50℃30'TNE(Tris-HClpH7.6+NaCl+EDTA)，37℃10'

RnaseA(1mg/100mlTNE)，37℃30'TNE，37℃10'2×SSC，50℃15'；0.2×SSC，50℃15'×2

嚴(yán)格度：甲酰胺濃度高溫度高高嚴(yán)格度離子強(qiáng)度低49分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件3.雜交后處理49分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件4.顯色反應(yīng)(大致同免疫組化)BufferⅠ(0.1MTris-HClpH7.5含0.15MNaCl)，室溫1'1.5%阻斷劑(用BufferⅠ加熱配制)，室溫45'抗DIG-AP，37℃30～60'，4℃過夜BufferⅠ，室溫15'×2BufferⅢ浸片(0.1MTris-HCl+0.1MNaCl+50mMMgCl2，pH9.5)，室溫5'，顯色液(NBT+BCIP+2mlBufferⅢ)，避光室溫，30'以上TE(10mMpH7.6Tris-HCl+1mMEDTA)中止反應(yīng)H2O洗片甘油明膠封片50分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件4.顯色反應(yīng)(大致同免疫組化)50分子病理學(xué)常用研究方法5.對(duì)照陰性組織片對(duì)照陽性組織片對(duì)照(包括分布)探針Northernblot檢測(cè)探針正義鏈陰性對(duì)照不標(biāo)記探針競(jìng)爭(zhēng)抑制不含探針的陰性對(duì)照(顯色階段對(duì)照)DNase或RNase消化后陰性對(duì)照(非核酸吸附)核酸原位雜交與蛋白產(chǎn)物的免疫組化檢測(cè)對(duì)照其他陽性或陰性對(duì)照（載體對(duì)照）51分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件5.對(duì)照51分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件四、雜交組化技術(shù)的進(jìn)展1.雙重及多重雜交組化技術(shù)（最好選擇不同的檢測(cè)系統(tǒng)）2.與免疫組化結(jié)合應(yīng)用雙重檢測(cè)(一般先作免疫組化)同時(shí)檢測(cè)核酸和蛋白產(chǎn)物3.電鏡下的雜交組化方法與免疫電鏡相似多采用PG或PLP固定、包埋后法、膠體金標(biāo)記細(xì)胞則多用包埋前法52分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件四、雜交組化技術(shù)的進(jìn)展52分子病理學(xué)常用研究方法ppt課4.原位PCR技術(shù)將PCR與雜交技術(shù)結(jié)合起來，以提高敏感性間接原位PCR：先擴(kuò)增后雜交方便、敏感、特異性差直接原位PCR：加入引物、標(biāo)記核苷酸、DNA聚合酶等，直接以靶鏈為模板合成DNA并檢測(cè)出相對(duì)的DNA雜合體5.原位反轉(zhuǎn)錄PCR（也分直接和間接法）在PCR擴(kuò)增前先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，rTth酶的出現(xiàn)使其更為容易53分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件4.原位PCR技術(shù)53分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件五、雜交組化的應(yīng)用1.病原體的檢測(cè)病毒：HPV(16，18)──宮頸癌

EBV──鼻咽癌

HBV──肝癌、肝炎──腎炎(IgA腎病)

CMV──AIDS病等原位PCR顯示肝炎肝細(xì)胞內(nèi)HCV陽性54分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件五、雜交組化的應(yīng)用原位PCR顯示肝炎肝細(xì)胞內(nèi)HCV陽性54

2.腫瘤基因檢測(cè)癌基因的染色體定位癌基因mRNA檢測(cè)──癌基因活化宮頸癌癌細(xì)胞內(nèi)p53的表達(dá)55分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件宮頸癌癌細(xì)胞55分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件3.mRNA檢測(cè)(敏感性較Northernblot低，可精確到細(xì)胞水平)原位雜交顯示腎小球系膜細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞TIMP-2陽性56分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件3.mRNA檢測(cè)原位雜交顯示腎小球系膜細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞T熒光原位雜交---FluorescenceInSituHybridization原理采用熒光標(biāo)記的DNA探針，利用探針與被檢測(cè)樣本DNA堿基對(duì)的互補(bǔ)性，在探針與樣本的DNA雜交后，通過熒光顯微鏡檢測(cè)熒光信號(hào)而得出結(jié)果，從而檢測(cè)細(xì)胞，組織樣本中的染色體異常。57分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件熒光原位雜交原理57分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件FISH：“釣魚”技術(shù)58分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件FISH：“釣魚”技術(shù)58分子病理學(xué)常用研究方法p59分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件59分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件細(xì)胞周期的不同階段60分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件細(xì)胞周期的不同階段60分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件61分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件61分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件探針是一段熒光標(biāo)記的核酸（DNA）片段，被用作尋找另一互補(bǔ)DNA(靶標(biāo)）的指示。DNA靶標(biāo)可能是一個(gè)特異性條帶、一個(gè)基因、一個(gè)染色體片段或一個(gè)完整染色體探針（probe)及靶標(biāo)（target)62分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件探針是一段熒光標(biāo)記的核酸探針（probe)及靶標(biāo)（targ適用于間期FISH的標(biāo)本石蠟切片分離細(xì)胞核腫瘤組織的印片細(xì)胞離心涂片血液或骨髓涂片細(xì)胞爬片或切片63分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件適用于間期FISH的標(biāo)本石蠟切片63分子病理學(xué)常用研究方FISH探針的類型全染色體涂抹探針（WCP）染色體計(jì)數(shù)（著絲粒）探針（CEP）位點(diǎn)特異性探針（LSI）雙色分離重排探針雙色雙融合易位探針xyxx64分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件FISH探針的類型全染色體涂抹探針（WCP）xyxx64可檢測(cè)樣本包括65分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件可檢測(cè)樣本包括65分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件66分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件66分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件臨床應(yīng)用領(lǐng)域67分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件臨床應(yīng)用領(lǐng)域67分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件68分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件68分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC基因69分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC基因69分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件70分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件70分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件

HPV→hTERC=宮頸癌？71分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件

HPV→hTERC=宮頸癌？71分子病理學(xué)常用研究方72分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件72分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件子宮頸癌研究最新進(jìn)展中國醫(yī)學(xué)論壇報(bào)/2008年/12月/4日/第B03版IGCS2008會(huì)議報(bào)道hTERC擴(kuò)增診斷宮頸癌及癌前病變

目前宮頸癌篩查主要通過宮頸細(xì)胞學(xué)檢查及人乳頭狀瘤病毒（HPV）檢測(cè)，但這些方法的臨床應(yīng)用均有一定局限性。今年的研究致力于尋找新的指標(biāo)來協(xié)助診斷宮頸癌前病變，尤其是鑒別出高度病變，以提高篩查的準(zhǔn)確性和可預(yù)測(cè)性。人端粒酶RNA（hTERC）是人端粒酶組分之一，有研究證實(shí)，端粒酶激活是HPV整合入宮頸細(xì)胞后，上皮內(nèi)瘤樣病變（CIN）向?qū)m頸癌轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟。此次大會(huì)口頭報(bào)告中北京大學(xué)人民醫(yī)院魏麗惠等提交的一項(xiàng)研究頗為引人注目，該研究發(fā)現(xiàn)，通過熒光原位雜交（FISH）檢測(cè)宮頸細(xì)胞學(xué)涂片中hTERC基因擴(kuò)增情況，在宮頸癌和癌前病變?cè)\斷中具有重要價(jià)值。73分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件子宮頸癌研究最新進(jìn)展中國醫(yī)學(xué)論壇報(bào)/2008年/12月/4日TERC與子宮頸癌級(jí)別國內(nèi)1000多例臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果74分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC與子宮頸癌級(jí)別國內(nèi)1000多例臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果74分子病TERC在臨床中的意義75分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC在臨床中的意義75分子病理學(xué)常用研究方法ppt課TERC在臨床中的意義-風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)針對(duì)HPV高危的宮頸癌易感人群,在常規(guī)TCT篩查的基礎(chǔ)上,加做TERC基因檢測(cè),可幫助醫(yī)生判斷病人疾病風(fēng)險(xiǎn)76分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC在臨床中的意義-風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)針對(duì)HPV高危的宮頸癌易感人

改進(jìn)的子宮頸癌篩查與診斷手段77分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件改進(jìn)的子宮頸癌篩查與診斷手段77分子病理學(xué)常用研究方法TERC在臨床中的意義-CIN1患者的分流治療78分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC在臨床中的意義-CIN1患者的分流治療78分子病TERC在臨床中的意義-CIN1患者的分流治療79分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC在臨床中的意義-CIN1患者的分流治療79分子病理TERC在臨床中的意義-CIN2患者的分流治療80分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC在臨床中的意義-CIN2患者的分流治療80分子病理TERC在臨床中的意義-術(shù)后評(píng)估，復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)

TERC（-）：手術(shù)病灶切除干凈，并無復(fù)發(fā)，定期隨訪觀察TERC（+）：高度懷疑有病灶沒有被完全切除，或者有復(fù)發(fā)。根據(jù)病人情況再次進(jìn)行手術(shù)治療81分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC在臨床中的意義-術(shù)后評(píng)估，復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)

TERC（-）：TERC在臨床中的意義-鑒別診斷對(duì)于30歲以前HPV陽性的病人，大多是一過性感染，可用TERC探針進(jìn)行鑒別診斷。

TERC（-）：一過性感染TERC（+）：有癌變風(fēng)險(xiǎn)，采取治療措施對(duì)于懷孕期的婦女，雌激素可使移行帶區(qū)的基底細(xì)胞出現(xiàn)不典型增生甚至類似原位癌的改變，與宮頸原位癌鑒別困難。但前者在產(chǎn)后能恢復(fù)正常。TERC（-）：雌激素引起，無需治療，產(chǎn)后自然恢復(fù)正常TERC（+）：高度懷疑原位癌，密切隨診，產(chǎn)后六周進(jìn)行相應(yīng)治療82分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC在臨床中的意義-鑒別診斷對(duì)于30歲以前HPV陽性的病TERC在臨床中的意義-鑒別診斷CIN1和CIN2病理學(xué)上有時(shí)難以區(qū)分，但是對(duì)指導(dǎo)臨床的治療有重要意義TERC（-）：90%可能為CIN1，按CIN1方案治療TERC（+）：90%可能為CIN2，按CIN2方案治療83分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC在臨床中的意義-鑒別診斷CIN1和CIN2病理學(xué)上有TERC指導(dǎo)臨床治療小結(jié)84分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC指導(dǎo)臨床治療小結(jié)84分子病理學(xué)常用研究方法ppt臨床常用檢測(cè)項(xiàng)目-宮頸癌85分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件臨床常用檢測(cè)項(xiàng)目-宮頸癌85分子病理學(xué)常用研究方法pp三種檢測(cè)方法比較方法特異性（％）敏感性（％）形態(tài)學(xué)檢測(cè)9055-80HPV檢測(cè)64－9584-100FISH909086分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件三種檢測(cè)方法比較方法特異性（％）敏感性（％）形態(tài)學(xué)檢測(cè)905TERC基因陽性圖原位癌術(shù)后復(fù)查87分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC基因陽性圖原位癌術(shù)后復(fù)查87分子病理學(xué)常用研究方法TERC基因陰性圖88分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC基因陰性圖88分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC基因FISH檢測(cè)檢測(cè)樣本：TCT采集、生理鹽水采集、活檢標(biāo)本石蠟切片、手術(shù)標(biāo)本石蠟切片89分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC基因FISH檢測(cè)檢測(cè)樣本：89分子病理學(xué)常用研究方法90分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件90分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件FISH檢測(cè)TERC基因的結(jié)果判讀：標(biāo)本為新鮮宮頸細(xì)胞制片：閾值建立采集20例正常人宮頸細(xì)胞。閾值測(cè)定：每例分析至少100個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)2個(gè)以上TERC信號(hào)細(xì)胞數(shù)目的百分比。閾值=平均數(shù)（M）+3X標(biāo)準(zhǔn)差（SD）結(jié)果判斷每例樣本隨機(jī)計(jì)數(shù)細(xì)胞（至少100個(gè)），如果檢測(cè)值大于閾值，判定為陽性結(jié)果；如果檢測(cè)值小于閾值，判定為陰性結(jié)果；如果檢測(cè)值等于閾值，加大觀測(cè)樣本細(xì)胞數(shù)目。標(biāo)本為組織石蠟切片：連續(xù)3個(gè)細(xì)胞出現(xiàn)2個(gè)以上TERC信號(hào)，即判為陽性。91分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件FISH檢測(cè)TERC基因的結(jié)果判讀：91分子病理學(xué)常用研究方FISH檢測(cè)Her-2基因擴(kuò)增92分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件FISH檢測(cè)Her-2基因擴(kuò)增92分子病理學(xué)常用研究方法93分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件93分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件94分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件94分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件95分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件95分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件96分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件96分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件97分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件97分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件Her-2基因擴(kuò)增模式98分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件Her-2基因擴(kuò)增模式98分子病理學(xué)常用研究方法ppt課Her-2基因擴(kuò)增模式99分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件Her-2基因擴(kuò)增模式99分子病理學(xué)常用研究方法ppt課100分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件100分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件赫賽汀在胃癌中的應(yīng)用101分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件赫賽汀在胃癌中的應(yīng)用101分子病理學(xué)常用研究方法ppt課102分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件102分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件隨訪終點(diǎn)指標(biāo)103分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件隨訪終點(diǎn)指標(biāo)103分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件赫賽汀在胃癌中的應(yīng)用—小結(jié)104分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件赫賽汀在胃癌中的應(yīng)用—小結(jié)104分子病理學(xué)常用研究方法p105分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件105分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TOP2A基因106分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TOP2A基因106分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件測(cè)TOP2A基因的意義107分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件測(cè)TOP2A基因的意義107分子病理學(xué)常用研究方法ppt108分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件108分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)Ratio值（紅信號(hào)數(shù)/綠信號(hào)數(shù)）FISH陽性：1.EGFR基因擴(kuò)增（1）Ratio≥2為陽性結(jié)果，提示該樣本有EGFR基因擴(kuò)增（2）大于等于15個(gè)紅色信號(hào)的細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的10%以上，為陽性結(jié)果，提示該樣本有EGFR基因擴(kuò)增（3）出現(xiàn)成團(tuán)擴(kuò)增的細(xì)胞，為陽性結(jié)果，提示該樣本有EGFR基因擴(kuò)增2.高多體性

Ratio＜2，但大于等于4個(gè)紅色信號(hào)的細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的40%以上，為陽性結(jié)果，提示該樣本為EGFR基因高多體性擴(kuò)增FISH陰性除以上陽性情況上，其余結(jié)果均為陰性結(jié)果109分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)Ratio值（紅信號(hào)數(shù)/綠信號(hào)數(shù)）10淋巴瘤的診斷和治療——對(duì)病理醫(yī)生和臨床醫(yī)生的挑戰(zhàn)淋巴瘤的分類復(fù)雜（2008年WHO分類）不同類型的淋巴瘤有著不同的預(yù)后，需要不同的治療；即使是相同類型的腫瘤，由于攜帶不同的分子遺傳學(xué)異常，對(duì)治療的反應(yīng)也可能不同;多數(shù)淋巴瘤綜合臨床特征、組織形態(tài)學(xué)、免疫表型特征可得到正確診斷;分子遺傳學(xué)的檢測(cè)可以提供更多普通病理學(xué)檢查所不能提供的信息。110分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件淋巴瘤的診斷和治療——淋巴瘤的分類復(fù)雜（2008年WHO分診斷BCDA臨床特征形態(tài)學(xué)免疫表型分子遺傳學(xué)淋巴瘤診斷—臨床特征、形態(tài)學(xué)、免疫表型及分子遺傳學(xué)相結(jié)合111分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件診斷BCDA臨床特征形態(tài)學(xué)免疫表型分子遺傳學(xué)淋巴瘤診斷1淋巴瘤常見的染色體易位及所累及基因112分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件淋巴瘤常見的染色體易位及所累及基因112分子病理學(xué)常用研究方FISH檢測(cè)淋巴瘤分子遺傳學(xué)異常的常用探針雙色分離重排探針（DualColorBreakApartRearrangementProbe）雙色雙融合易位探針（DualColor，DualFusionTranslocationProbe）染色體計(jì)數(shù)探針（Chromosomeenumerationprobe,CEP）113分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件FISH檢測(cè)淋巴瘤分子遺傳學(xué)異常的常用探針雙色分離重排探針1①切片準(zhǔn)備：選擇雜交區(qū)域，脫蠟水化、酶消化、脫水干燥②變性、雜交③洗滌、封片④觀察：熒光顯微鏡。間期FISH方法114分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件①切片準(zhǔn)備：選擇雜交區(qū)域，脫蠟水化、酶消化、間期FISH方法間期FISH結(jié)果觀察與解讀115分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件間期FISH結(jié)果觀察與解讀115分子病理學(xué)常用研究方法p雙色分離重排探針（BCL2）正常分離基因拷貝數(shù)增加116分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件雙色分離重排探針（BCL2）正常分離基因拷貝數(shù)增加116分子間期FISH結(jié)果觀察與解讀117分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件間期FISH結(jié)果觀察與解讀117分子病理學(xué)常用研究方法p正常融合基因拷貝數(shù)增加雙色融合易位探針(IGH/BCL2）118分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件正常融合基因拷貝數(shù)增加雙色融合易位探針(IGH/BCL2）間期FISH結(jié)果觀察與解讀119分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件間期FISH結(jié)果觀察與解讀119分子病理學(xué)常用研究方法p正常染色體數(shù)目增加染色體著絲粒探針（2號(hào)染色體，橙色）120分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件正常染色體數(shù)目增加染色體著絲粒探針120分子病理學(xué)常用研究方有助于診斷、分類通過特異性遺傳學(xué)異常來確定淋巴瘤的類型判定預(yù)后、指導(dǎo)治療

FISH檢測(cè)淋巴瘤分子遺傳學(xué)異常的意義121分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件有助于診斷、分類FISH檢測(cè)淋巴瘤分子遺傳學(xué)異常的意義121間期FISH在淋巴瘤中的應(yīng)用舉例侵襲性成熟B細(xì)胞淋巴瘤小細(xì)胞性B細(xì)胞淋巴瘤

外周T細(xì)胞淋巴瘤

B淋巴母細(xì)胞性淋巴瘤/白血病122分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件間期FISH在淋巴瘤中的應(yīng)用舉例侵襲性成熟B細(xì)胞淋巴瘤12Burkitt淋巴瘤(BL)t(8q24)/IG-cMYC具有介于彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤之間特征的不能分類的B細(xì)胞淋巴瘤(IntermediateBL/DLBCL)（Double-hit）t(8q24)/nonIG-cMYC（35-50%）t(14;18)(q32;q21)/IGH-BCL2

（15%）t(3q27)/BCL6-IGH

（少）彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)（Double-hit）

t(8q24)/IG(nonIG)-cMYC（10%）

t(3q27)/BCL6（30%）t(14;18)(q32;q21)/IGH-BCL2

（20-30%）t(3;14)(p14;q32)/FOXP1-IGH（3%）侵襲性成熟B細(xì)胞淋巴瘤123分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件Burkitt淋巴瘤(BL)侵襲性成熟B細(xì)胞淋巴瘤123分利用FISH檢測(cè)以上三個(gè)類型淋巴瘤的分子遺傳學(xué)異常，通常使用以下探針：雙色分離重排探針：IGH、C-MYC、BCL2、BCL6雙色雙融合易位探針：IGH/C-MYC

侵襲性成熟B細(xì)胞淋巴瘤124分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件利用FISH檢測(cè)以上三個(gè)類型淋巴瘤的分子遺傳學(xué)異常，通常使用Burkitt淋巴瘤

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