基因表達(dá)載體的構(gòu)建

會(huì)計(jì)學(xué)1基因表達(dá)載體的構(gòu)建第一節(jié)基因表達(dá)的概述和基本條件一、基因表達(dá)的基本概念二、基因表達(dá)的基本條件三、真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)及調(diào)控第1頁(yè)/共49頁(yè)第二節(jié) 在大腸桿菌中影響外源基因表達(dá)的一、啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)對(duì)因表達(dá)素效率的影響二、表達(dá)載體的選擇三、外源基因（cDNA）中密碼子的作用四、mRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)與基因表達(dá)五、mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)翻譯起始的影響六、mRNA穩(wěn)定性的影響七、轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對(duì)外源基因表達(dá)效率的影響八、轉(zhuǎn)錄后的若干因素與基因表達(dá)的關(guān)系九、宿主選擇對(duì)表達(dá)的影響十、培養(yǎng)條件的控制對(duì)表達(dá)效率的影響第2頁(yè)/共49頁(yè)一、基因表達(dá)的基本概念生物體的遺傳信息都是以核苷酸序列編碼的形式儲(chǔ)存在遺傳物質(zhì)DNA上,基因表達(dá)是目的基因DNA在導(dǎo)入的細(xì)胞

內(nèi)轉(zhuǎn)錄成mRNA,再以mRNA指導(dǎo)翻譯成蛋白質(zhì)?；虻谋磉_(dá)依賴于有效的轉(zhuǎn)錄和

mRNA的正確翻譯以及翻譯后的加工處理等第3頁(yè)各/共49頁(yè)個(gè)環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)作用，其中轉(zhuǎn)錄最為關(guān)鍵，原核的基因表達(dá)過(guò)程和方式與真二、基因表達(dá)的基本條件

1.外源基因插入序列必須保持正確的方向和閱讀框架。其遺傳密碼不得缺失、遺漏、或錯(cuò)位及錯(cuò)碼。否則會(huì)

導(dǎo)致編碼錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)分子，特別是目的基因序列內(nèi)

部應(yīng)不含兩端酶切位點(diǎn)的識(shí)別序列。

2.插入的外源基因必須放在原核的啟動(dòng)子控制之下，也就是使原核的RNA聚合酶能夠識(shí)別插入的基因。

3.外源基因必須能在大腸桿菌中進(jìn)行有效轉(zhuǎn)錄（如無(wú)內(nèi)含子），轉(zhuǎn)錄后的mRNA在菌體必須相當(dāng)穩(wěn)定，并

且能有效地進(jìn)行翻譯，轉(zhuǎn)譯的蛋白分子在菌體內(nèi)不致于受菌體蛋白酶的降解。第4頁(yè)/共49頁(yè)三、真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)及調(diào)控真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)及調(diào)控的特點(diǎn)㈠有效轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控元件㈡正確轉(zhuǎn)譯㈢原核表達(dá)載體的構(gòu)建第5頁(yè)/共49頁(yè)㈠有效轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控元件1.RNA聚合酶

2.啟動(dòng)子及其轉(zhuǎn)錄作用的啟動(dòng)（啟動(dòng)子的概念、分類）3.轉(zhuǎn)錄作用的終止4.轉(zhuǎn)錄的弱化作用第6頁(yè)/共49頁(yè)㈡正確轉(zhuǎn)譯1.起始密碼子（intiqtion

codon,initiator）2.核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS，又稱SD序列）第7頁(yè)/共49頁(yè)㈢原核表達(dá)載體的構(gòu)建原核表達(dá)載體的構(gòu)建的要求1.表達(dá)載體類型2.表達(dá)載體的舉例3.包涵體表達(dá)載體第8頁(yè)/共49頁(yè)啟動(dòng)子⑴乳糖啟動(dòng)子（Lac）⑵Trp啟動(dòng)子⑶Tac啟動(dòng)子⑷噬菌體的PL和PR啟動(dòng)子⑸脂蛋白啟動(dòng)子（LPP）第9頁(yè)/共49頁(yè)啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)對(duì)表達(dá)效率的影響

啟動(dòng)子-35區(qū)和-10區(qū)序列與通用轉(zhuǎn)錄序列一致，間距為17

bp，大于17bp效果差，不同產(chǎn)物選用不同啟動(dòng)子，如尿激酶用ptac，IL2/2FU-V用PRPL啟動(dòng)子效果好。第10頁(yè)/共49頁(yè)表達(dá)載體的選擇

載體分子量不宜過(guò)大，以2.5-5.6kb為佳，高拷貝，不同產(chǎn)物選用不同類型表達(dá)載體。第11頁(yè)/共49頁(yè)外源基因（cDNA）中密碼子的作用

細(xì)菌中基因表達(dá)對(duì)密碼子有偏愛(ài)性，不偏愛(ài)的稀有密碼子（AGA、AGG）表達(dá)效果

差，特別當(dāng)有AGA-AGG連續(xù)序列存在時(shí)表達(dá)效率低第12頁(yè)/共49頁(yè)mRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)與基因表達(dá)啟始密碼子：表達(dá)效率AUG>GUG>UUG

SD序列：較長(zhǎng)的效率高，如

UAAGGAGG比AAGAA高三倍；SD序列與AUG間距一般6-12bp，4-10bp較佳，9bp最佳；SD序列的5’非翻譯區(qū)，若有5’-UGAUCU，則有增強(qiáng)作用。第13頁(yè)/共49頁(yè)mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)翻譯起始的影響

mRNA形成二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，可產(chǎn)生莖環(huán)。若

SD序列、AUG位于莖環(huán)內(nèi)或發(fā)夾內(nèi)，轉(zhuǎn)譯受抑制；在莖環(huán)外則有利于轉(zhuǎn)譯。見(jiàn)表6-1第14頁(yè)/共49頁(yè)mRNA穩(wěn)定性的影響

REP序列可阻止mRNA降解，偏愛(ài)密碼子也起保護(hù)作用。第15頁(yè)/共49頁(yè)真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)及調(diào)控的特點(diǎn)1.2.3.4.5.6.7.只有一種RNA聚合酶以操縱子為單位來(lái)完成基因轉(zhuǎn)錄基因轉(zhuǎn)錄無(wú)RNA剪接功能因無(wú)核仁、核膜，核酸均為裸露的，轉(zhuǎn)錄與翻譯是連續(xù)進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在多聚核糖體上合成，同時(shí)合成多條肽鏈有特有SD序列，調(diào)控mRNA與核糖體有效結(jié)合和翻譯的起始無(wú)糖基化功能第16頁(yè)/共49頁(yè)RNA聚合酶

原核細(xì)胞只有一種RNA聚合酶，當(dāng)其核心酶與σ因子結(jié)合，形成全酶后，才能識(shí)別

DNA上的啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。第17頁(yè)/共49頁(yè)啟動(dòng)子的概念

啟動(dòng)子是位于結(jié)構(gòu)基因上游，轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控所必需的一段DNA序列，內(nèi)含-35區(qū)（與σ因子結(jié)合）和-10區(qū)（和核心酶結(jié)合）的保守序列。當(dāng)啟動(dòng)子與全酶結(jié)合后可在+1轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，如圖6-1。第18頁(yè)/共49頁(yè)轉(zhuǎn)錄作用的終止

由轉(zhuǎn)錄終止子發(fā)揮作用，凡能使轉(zhuǎn)錄終止的有關(guān)的DNA的序列稱終止子。

強(qiáng)終止子：不依賴ρ因子發(fā)揮終止作用，回文序列中G/C配對(duì)多，有四個(gè)以上U，致使

RNA聚合酶構(gòu)象改變而終止轉(zhuǎn)錄。如圖6-9,如圖6-10

弱終止子：依賴ρ因子發(fā)揮終止作用。如圖6-11第19頁(yè)/共49頁(yè)轉(zhuǎn)錄的弱化作用

轉(zhuǎn)錄的弱化作用使轉(zhuǎn)錄沒(méi)有到達(dá)終止信號(hào)處而中途停止轉(zhuǎn)錄，使mRNA轉(zhuǎn)錄發(fā)生部分停止，而不是發(fā)生全部停止。第20頁(yè)/共49頁(yè)起始密碼子

起始密碼子是編碼多肽鏈第一位氨基酸的密碼子AUG（或ATG），編碼甲硫氨酸（蛋氨酸）。在細(xì)菌中也有罕見(jiàn)的起始密碼子GUG，編碼纈氨酸。其起始表達(dá)作用

AUG＞GUG。第21頁(yè)/共49頁(yè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)

轉(zhuǎn)錄mRNA的AUG上游具有的，能與核糖體發(fā)生有效結(jié)合和轉(zhuǎn)譯所需要的序列（RBS），長(zhǎng)度為3-9bp，距AUG3-11bp，它與16srRNA3’末端（AUUCCUCCAC-DAG-5’）互補(bǔ)其互補(bǔ)程度、SD與AUG間距等與轉(zhuǎn)譯效果有關(guān)。如圖第22頁(yè)/共49頁(yè)表達(dá)載體類型1.2.3.4.表達(dá)載體的類型主要有四種：非融合型表達(dá)載體，如PKK223-3如圖6-14分泌型表達(dá)載體，如PINⅢ-ompA1如圖6-15融合蛋白型表達(dá)載體，如PGEX如圖6-16

包涵體型表達(dá)載體，如pBV220如圖6-17第23頁(yè)/共49頁(yè)原核表達(dá)載體的構(gòu)建的要求完整的表達(dá)載體（質(zhì)粒）應(yīng)有強(qiáng)啟動(dòng)子（P）、終止子（T）、多個(gè)酶切位點(diǎn)、有

抗性標(biāo)記、復(fù)制子和RBS的SD序列。（如

圖6-13）還應(yīng)結(jié)合考慮：質(zhì)粒的拷貝能力和穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)譯蛋白的表達(dá)形式和存放地點(diǎn)（分泌型/包涵體/融合蛋白），蛋白質(zhì)的分子量、性質(zhì)和穩(wěn)定性以及選擇合適宿主細(xì)胞。第24頁(yè)/共49頁(yè)乳糖啟動(dòng)子（Lac）

無(wú)乳糖時(shí)，調(diào)節(jié)基因（I）產(chǎn)生阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合，阻止RNA聚合酶結(jié)合進(jìn)而

阻止轉(zhuǎn)錄；有乳糖時(shí)，乳糖能與阻遏蛋白結(jié)合，使其變構(gòu)解離而行使轉(zhuǎn)錄功能。如圖6-2

而LacZ基因可由IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖）誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。Lac啟動(dòng)子改建如圖6-3、6-4(a)(b)第25頁(yè)/共49頁(yè)Trp啟動(dòng)子

色氨酸啟動(dòng)子（

Trp）的阻遏蛋白在有色氨酸時(shí)，二者結(jié)合，阻遏蛋白變構(gòu)激活而與啟動(dòng)子結(jié)合，阻止RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄。無(wú)色氨酸時(shí)，阻遏解除，因β-吲哚丙烯酸是色氨酸的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，常用作誘導(dǎo)劑，誘

發(fā)色氨酸啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。（如圖6-5）同時(shí)，衰減子對(duì)Trp轉(zhuǎn)錄也有調(diào)節(jié)作用（如圖6-6）第26頁(yè)/共49頁(yè)Tac啟動(dòng)子

Tac啟動(dòng)子是由Trp啟動(dòng)子和Lac啟動(dòng)子構(gòu)建

而成的雜合啟動(dòng)子，-35區(qū)為T(mén)rp啟動(dòng)子順序，-10為L(zhǎng)acUV5啟動(dòng)子順序，二者之間距離為

16bp者為pTrc，17bp者為pTac。該啟動(dòng)子只需用IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄即可。如圖6-7第27頁(yè)/共49頁(yè)噬菌體的PL和PR啟動(dòng)子

PL為λφ左向啟動(dòng)區(qū)，PR為右向轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)，與CI阻遏蛋白結(jié)合，可抑制OL或OR

轉(zhuǎn)錄，

但CI在42℃誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄（如圖6-8）。第28頁(yè)/共49頁(yè)脂蛋白啟動(dòng)子（LPP）

脂蛋白為細(xì)胞外膜蛋白，細(xì)菌中含量高，該啟動(dòng)子表達(dá)效率高，由信號(hào)肽可將基因表達(dá)產(chǎn)物分泌到胞外，常用來(lái)構(gòu)造分泌型表達(dá)載體。第29頁(yè)/共49頁(yè)第30頁(yè)/共49頁(yè)第31頁(yè)/共49頁(yè)第32頁(yè)/共49頁(yè)第33頁(yè)/共49頁(yè)第34頁(yè)/共49頁(yè)第35頁(yè)/共49頁(yè)第36頁(yè)/共49頁(yè)第37頁(yè)/共49頁(yè)第38頁(yè)/共4