山楂中黃酮類化合物的提取及測(cè)定

山楂中黃酮類化合物的提取及測(cè)定

曼陀羅是植物科的一個(gè)分支。該屬約有15種,分布于熱帶和溫帶。一年生草本,在低緯度地區(qū)可長(zhǎng)成亞灌木。生于荒地、旱地、宅旁、路旁、向陽(yáng)山坡、林緣、草地?；ㄆ?~10月,果期7~11月。種子繁殖。莖直立,高1~2m。葉寬卵形,先端漸尖,基部不對(duì)稱楔形,邊緣有不規(guī)則波狀淺裂,裂片三角形,脈上有疏短柔毛?；ㄝ嗤矤?有五棱角,長(zhǎng)4~5cm;花冠漏斗狀,長(zhǎng)6~10cm,上部白色或紫色;花藥長(zhǎng)3~4mm。蒴果直立,卵球形,長(zhǎng)3~4cm,表面生有堅(jiān)硬的針刺,成熟后4瓣裂。種子黑色。我國(guó)有四種,南北各省區(qū)均有分布。野生或栽培。山東有四種。常見(jiàn)有白花曼陀羅。全草有毒,以果實(shí)特別是種子毒性最大,嫩葉次之。干葉的毒性比鮮葉小。有毒成分主要含東莨菪堿、莨菪堿,其次有阿托品、阿樸阿托品、降阿托品、曼陀羅素、惕各酰莨菪堿、曼陀羅堿、茵芋堿、2,6-二惕莨菪堿、紅古豆堿和7-羥基-3,6-二惕各酰氧托院。總生物堿含量開(kāi)花末期最高,到種子成熟時(shí)迅速下降。從種子還分出血球凝集素。關(guān)于曼陀羅中毒的報(bào)導(dǎo)較多,一般在食后30min,最快20min出現(xiàn)癥狀,最遲不超過(guò)3h;中毒劑量因毒性進(jìn)入途徑、年齡及健康狀況而異。曼陀羅全草入藥,具有鎮(zhèn)咳平喘、麻醉止痛、祛風(fēng)除濕的功效,能治哮喘、銀屑病、驚痛、風(fēng)濕痹痛、瘡瘍疼痛、脫肛、瀉痢等多種疾病。曼陀羅花治療銀屑病效果十分顯著。曼陀羅是重要的麻醉藥,可制作外科手術(shù)麻醉劑。起麻醉作用的主要成分是東莨菪堿。最近幾年,曼陀羅被廣泛用于麻醉養(yǎng)肉狗,制作誘捕野生動(dòng)物的麻醉劑和殺蟲(chóng)劑。由于其生理活性較強(qiáng),應(yīng)用廣泛,目前曼陀羅為國(guó)際市場(chǎng)上生產(chǎn)和流通量最大的八種藥用植物之一。我國(guó)植物資源豐富,但目前開(kāi)發(fā)利用尚很有限,應(yīng)根據(jù)曼陀羅制劑的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行工藝改進(jìn),以提高產(chǎn)品質(zhì)量。因此將選擇性好,操作簡(jiǎn)單的方法提取,分離曼陀羅有效成分,是一項(xiàng)很有意義的工作。1材料和方法1.1材料表面曼陀羅于2007年10月采自新疆烏魯木齊市天山區(qū)大灣村宅旁、路旁。經(jīng)植物教研室鑒定為心草全草。將全草晾干、粉碎,備用。1.2試劑蘆丁(rutin)對(duì)照品中國(guó)藥品生物制品檢定所;亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、三氯化鐵、無(wú)水乙醇、濃硫酸、鋅粉均為分析純。1.3儀器粉碎機(jī);電熱恒溫水浴鍋;索氏抽提器:可見(jiàn)光分光光度計(jì);分析天平;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱;離心機(jī);電子天平。1.4黃酮含量測(cè)定原理和方法1.4.1黃酮類化合物的量測(cè)黃酮類化合物主要包括黃酮苷和黃酮醇苷兩大部分。在黃酮類化合物溶液中加人鋁離子試劑后,黃酮類化合物中的酚經(jīng)基與A13+生成絡(luò)合物,控制適宜的pH值,所生成的絡(luò)合物在可見(jiàn)區(qū)能獲得特征吸收峰,其質(zhì)量濃度與吸光度符合比耳定律,其顏色的深淺與黃酮類化合物的量成一定的比例關(guān)系,可以定量測(cè)定。1.4.2黃酮類物質(zhì)的鑒定方法1.4.2.樣品的預(yù)處理鹽酸-鎂粉反應(yīng):在樣品液中加入少量鎂粉,再滴加1~2滴濃鹽酸,在沸水溶液中加熱3min,觀察反應(yīng)結(jié)果。三氯化鐵顯色反應(yīng):將樣品液滴于濾紙上,并滴加5%FeCl3指示劑,觀察反應(yīng)結(jié)果。鋁鹽反應(yīng):在樣品液中滴加1%AlCl3溶液,觀察反應(yīng)結(jié)果。1.4.2.反應(yīng)總反應(yīng)結(jié)果在樣品液中加入5%NaNO2溶液;搖勻,旋轉(zhuǎn)6min后,加入等體積10%Al(NO3)3溶液,6min后再加入4%NaOH溶液,混勻,用30%乙醇稀釋,觀察反應(yīng)結(jié)果。1.4.2.3.酸性試劑的顯色反應(yīng)在樣品液中加入濃硫酸觀察反應(yīng)結(jié)果。1.4.3單因素試驗(yàn)1.4.3.曼陀羅種子提取物的提取分別用55%、65%、75%、85%、95%的乙醇以50ml為一倍量對(duì)干燥曼陀羅種子粉末1g進(jìn)行加熱提取1h,將濾液離心、濃縮,然后于50ml容量瓶定容,測(cè)定其吸光度。1.4.3.曼不同濃度的乙醇提取分別用50、60、70、80、100ml量的95%乙醇對(duì)曼陀羅種子粉末1g進(jìn)行加熱回流提取1h,濾液離心、濃縮,然后于50ml容量瓶定容,測(cè)定其吸光度。1.4.3.種子提取物吸收劑的制備分別用80ml,95%的乙醇對(duì)干燥曼陀羅種子粉末1g進(jìn)行加熱提取1、1.5、2、2.5、3h,將濾液離心、濃縮,然后于50ml容量瓶定容,測(cè)定其吸光度。1.4.3.乙醇溶液的提取分別稱取五份干燥曼陀羅種子粉末,每份均為1g,各加80ml,95%乙醇于50、60、70、80、90℃進(jìn)行溫浸提取1h,濾液離心、濃縮,然后于50ml容量瓶定容,測(cè)定其吸光度。1.4.4黃酮類化合物的含量測(cè)定1.4.4.標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精密稱取干燥恒至重的蘆丁對(duì)照品0.0345g,置于100ml三角瓶中,先加30ml30%乙醇在水浴鍋加熱使其溶解,再定容至刻度,制成濃度為0.345mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。1.4.4.黃酮提取條件的確定準(zhǔn)確稱取1g粉末9份,選擇浸提溫度、乙醇濃度、浸提時(shí)間、乙醇用量四個(gè)因素,采用L9(34)正交設(shè)計(jì),因素和水平見(jiàn)表1,正交試驗(yàn)安排見(jiàn)表8。確定最佳的黃酮提取條件。然后準(zhǔn)確稱取樣品1g,以乙醇為溶劑,用最佳條件進(jìn)行提取,將乙醇浸提液過(guò)濾、濃縮,然后于30%乙醇定溶至50ml,搖勻,待測(cè)定。1.4.4.分光光度法分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液1ml,置于10ml容量瓶中,加入0.7ml5%NaNO2,搖勻,放置6min后加入0.7ml10%Al(NO3)3,放置6min再加入5ml4%NaOH溶液,混勻,用30%乙醇稀釋至刻度,同時(shí)作空白對(duì)照,10min后測(cè)定波長(zhǎng)400~600nm區(qū)段的吸光度,得知蘆丁最大吸光度在500nm,因此分光光度法選測(cè)定波長(zhǎng)為500nm。1.4.4.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml于7只25ml容量瓶中,用30%乙醇補(bǔ)充至12.5ml,再分別加入0.7ml5%NaNO2溶液,搖勻,放置6min后加入0.7ml10%Al(NO3)3溶液,搖勻,放置6min后再加入5ml4%的NaOH溶液,再加30%乙醇至刻度,搖勻,放置10min后離心l0min,取上清液于波長(zhǎng)500nm處測(cè)定吸光度,0.0ml為空白對(duì)照,測(cè)得不同濃度下的吸光度,見(jiàn)表2。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(C)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為:y=9.9715x-0.0053,R2=0.9988。1.4.4.波長(zhǎng)對(duì)測(cè)定總吸收劑用量精密量取樣品溶液0.0、1.0ml并置于25ml容量瓶中,用30%乙醇補(bǔ)充至12.5ml,再分別加入0.7ml5%NaNO2溶液,搖勻,放置6min后加入0.7ml10%Al(NO3)3溶液,搖勻,放置6min后再加入5ml的4%NaOH溶液,再加30%乙醇至刻度,搖勻,放置10min后離心l0min,取上清液于波長(zhǎng)500nm處測(cè)定吸光度,0.0ml為空白對(duì)照。所測(cè)樣品吸光度值經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程換算后,得出提取液總黃酮濃度,然后按下式計(jì)算提取率:提取率(%)=Y×稀釋倍數(shù)×V/W×100%=[(C×50×25)/(1×1000)]×100%C(mg/ml):根據(jù)所測(cè)定的溶液的吸光度值,代入回歸方程計(jì)算出相應(yīng)的總黃酮含量。1.4.4.黃酮提取條件的篩選在以上單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,對(duì)影響黃酮類化合物提取效果的因素提取溫度(A)、濃度(B)、時(shí)間(C)、料液比(D)進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),以確定最佳的黃酮提取條件。用移液管準(zhǔn)確吸取1ml樣品溶液,放入25ml容量瓶中,用30%乙醇補(bǔ)充至12.5ml,再加入0.7ml5%NaNO2溶液,搖勻,放置6min后加入0.7ml10%Al(NO3)3溶液,搖勻,放置6min后再加入5ml的4%NaOH溶液,再加30%乙醇至刻度,搖勻,放置10min后取上清液于波長(zhǎng)500nm處測(cè)定吸光度,按回歸方程計(jì)算出黃酮含量。2結(jié)果與分析2.1黃酮類化合物的鑒定顯色反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表3,說(shuō)明曼陀羅種子中含有黃酮類化合物。2.2最佳提取溫度的確定表4結(jié)果表明,在溶媒量溫度及時(shí)間一致的情況下,95%乙醇的提取效果比較好。表5結(jié)果表明,在乙醇濃度溫度及浸泡時(shí)間一致時(shí),溶媒量50~80ml時(shí)提取效果逐漸上升,并在80ml達(dá)到最大值,隨后出現(xiàn)下降趨勢(shì)。表6結(jié)果表明,50~60℃之間總黃酮含量逐漸上升,并在60℃達(dá)到最大值,隨后出現(xiàn)下降趨勢(shì),可能因?yàn)槌掷m(xù)高溫影響某些不穩(wěn)定的黃酮類化合物,而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)破壞,失去功能等,此最佳溫度選為60℃。表7結(jié)果表明,當(dāng)提取時(shí)間為1h時(shí),提取效果最佳。2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程2.4提取條件及提取溫度從表8可以看出最佳條件為A2B3C1D3,乙醇濃度95%、固液比1:70、提取溫度60℃、提取時(shí)間1h。對(duì)提取效果的影響A>C>D>B。3提取溶劑的選擇研究結(jié)果表