蛋白純化講座

蛋白純化的基本原理和應(yīng)用廣東省微生物所重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室莫翠云主要內(nèi)容蛋白質(zhì)的特點(diǎn)及研究價值生物大分子分離方法概述蛋白分離純化的一般原則蛋白分離純化的色譜技術(shù)蛋白質(zhì)的特點(diǎn)及研究價值沒有蛋白質(zhì)就沒有生命，蛋白質(zhì)是生物體中含量最高、功能最重要的生物大分子。20多種氨基酸可以組成人體內(nèi)的10萬余種蛋白質(zhì)分子。高純度的蛋白質(zhì)對研究未知蛋白的分子結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和生物活性有著重要價值。生物工程工藝流程中，下游工程的投入常常超過總投入60％。干擾素售價高達(dá)1千萬/克，80％的成本用在難度大、費(fèi)用高的分離純化上。生物大分子分離方法概述傳統(tǒng)方法：沉淀、透析、超濾和溶劑萃取等。現(xiàn)代分離技術(shù)：毛細(xì)管電泳、色譜（理論塔板數(shù)可達(dá)百萬數(shù)量級）。但毛細(xì)管電泳不能用于生產(chǎn)規(guī)模的生物大分子的分離純化，而在生物技術(shù)制取蛋白質(zhì)的多級純化過程中，液相色譜被指定為一個“必需步驟”，成為實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)生產(chǎn)上分離純化及制備生物大分子最常用和有效的方法。蛋白質(zhì)分離純化的一般原則基本原則：從復(fù)雜的多組分物質(zhì)中將目標(biāo)組分分離，盡可能多的獲得具有生物學(xué)活性的蛋白和多肽產(chǎn)物，并增加目標(biāo)產(chǎn)物的純度和比活性，必須避免目標(biāo)蛋白和多肽的變性及降解。了解和牢固掌握：目標(biāo)蛋白的物理化學(xué)、生物學(xué)特性以選擇合適的單元操作，其中包括選材、提取純化目標(biāo)蛋白及后續(xù)的定性定量鑒定。蛋白質(zhì)分離純化的一般步驟目標(biāo)蛋白的釋放：選材合適，使目標(biāo)蛋白盡可能維持天然構(gòu)象狀態(tài)下釋放。動物組織（電動攪碎或勻漿處理），帶細(xì)胞壁的細(xì)菌和植物細(xì)胞（超聲波、研磨、酶法消化、低溫冰凍等）。初步純化：蛋白質(zhì)溶液選擇適當(dāng)?shù)募兓僮魇鼓繕?biāo)蛋白與雜質(zhì)分離，在保持活性的前提下使產(chǎn)物濃度及質(zhì)量有明顯提高。高度純化（精細(xì)純化）：主要采用色譜技術(shù)，如離子交換、親和、分子排阻、疏水等。具高度選擇性，可去除物化性質(zhì)相近的雜質(zhì)。蛋白質(zhì)分離純化的一般步驟成品的加工：濃縮、結(jié)晶和冷凍干燥（保持天然活性）。相應(yīng)的鑒定：純度可用電泳、色譜等方法；相應(yīng)的活性鑒定方法，其他方法。蛋白質(zhì)分離純化的色譜技術(shù)按分離機(jī)制可劃分為：吸附色譜分離法、共價作用色譜分離法、凝膠過濾色譜分離法、分配色譜分離法。蛋白質(zhì)分離純化的色譜技術(shù)——凝膠排阻色譜（1）定義：又稱分子排阻、分子篩色譜等。根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。介質(zhì)：大分子惰性聚合物（如交聯(lián)葡聚糖）。流出順序：大分子先出，小分子后出。優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡單易操作，不需梯度泵；根據(jù)已知組分可推算未知組分尺寸大?。簧V柱壽命長。蛋白質(zhì)分離純化的色譜技術(shù)——凝膠排阻色譜（2）應(yīng)用范圍：對抗原抗體的分離純化；去除混合組分中的小分子物質(zhì)，如脫鹽及水解的蛋白質(zhì)碎片等；與其他手段聯(lián)用分析分離免疫復(fù)合物及分子量大小和分子量在混合物中的分布。蛋白質(zhì)分離純化的色譜技術(shù)——凝膠排阻色譜（3）缺點(diǎn)：分離度較低，色譜峰容量小，樣品單次處理量很小。上樣量一般為柱床體積的0.5％-4.0％，要想得到最大分辨率則不可超過柱床體積的2.0％。影響因素多：柱子直徑、填料填充密度、洗脫流速、樣品和緩沖液的粘稠度等因素都極大的影響分辨率、回收率及分離時間。蛋白質(zhì)分離純化的色譜技術(shù)——疏水作用層析（1）原理：根據(jù)蛋白表面疏水性差異進(jìn)行純化，要求蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)暴露，因此需要通過鹽析（如加入硫酸胺）。可通過調(diào)整樣品溶液pH值至蛋白pI附近從而使蛋白吸附達(dá)到最大量。洗脫方式：可通過降低緩沖液離子強(qiáng)度或增加pH值來增加蛋白質(zhì)親水性等。蛋白質(zhì)分離純化的色譜技術(shù)——疏水作用層析（2）技術(shù)關(guān)鍵：選擇合適的配基結(jié)構(gòu)，摸索階段優(yōu)先選擇中等結(jié)合力介質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：可作為離子交換純化的下一步操作，這樣疏水作用層析在高鹽下上樣吸附蛋白，不需離子交換層析產(chǎn)物換液，即達(dá)到純化蛋白又達(dá)到換液的目的，節(jié)約時間，減少蛋白的損失。蛋白質(zhì)分離純化的色譜技術(shù)——親和層析（1）分離原理：利用蛋白質(zhì)對層析介質(zhì)上的配體特異專一識別，通過生物學(xué)親和力可逆的結(jié)合。例如純化酶時配體可以是底物、可逆抑制劑、相對應(yīng)的競爭性抑制劑或別構(gòu)效應(yīng)物；利用已經(jīng)制備好的固相抗體（或抗原）純化相應(yīng)抗原（或抗體）等建立起高分辨純化方法。蛋白質(zhì)分離純化的色譜技術(shù)——親和層析（2）注意事項(xiàng)：在純化蛋白質(zhì)時，介質(zhì)上的單抗與待分離目標(biāo)蛋白結(jié)合力很強(qiáng)，需要較為苛刻的洗脫條件，這樣會使蛋白失活并破壞單抗；同時混合物中蛋白酶也可能破壞抗體或與之非特異性結(jié)合；一些單抗也會在純化過程中解離下來混入目標(biāo)產(chǎn)物，因此要從最終產(chǎn)物中去除。工藝中位置：最后使用，經(jīng)前面單元操作處理后樣品體積減少，大部分雜質(zhì)已去除，減少了親和層析的壓力。蛋白質(zhì)分離純化的色譜技術(shù)——親和層析（3）應(yīng)用：大規(guī)模應(yīng)用在酶制劑、抗體等的分離精制，核酸；小規(guī)模應(yīng)用在核酸、免疫球蛋白、膜受體、核苷酸、細(xì)胞器甚至完整細(xì)胞的純