環(huán)孢素對(duì)大鼠胰性腦病腦組織損害的保護(hù)作用

環(huán)孢素對(duì)大鼠胰性腦病腦組織損害的保護(hù)作用

重癥急性胰腺（cp）疾病患者的病因有許多不同的機(jī)制，單因素不能全面解釋。PE的發(fā)病并非單純的胰酶變化所致,而更多的是與免疫異常有關(guān)。輔助T淋巴細(xì)胞(Th)1、2在介導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答過程中扮演著不同的角色,檢測(cè)PE病人的腦組織Th1和Th2類細(xì)胞因子(CK),有助于判斷PE的發(fā)生發(fā)展和制定相應(yīng)的治療方案。環(huán)孢素(cyclosporineA,CsA)作為一種T淋巴細(xì)胞功能調(diào)節(jié)藥,可以抑制包括T細(xì)胞生長(zhǎng)因子(IL-2)在內(nèi)的眾多細(xì)胞因子的合成。本研究擬應(yīng)用CsA作用于大鼠PE模型,觀察其腦組織勻漿中代表Th1CK的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及代表Th2CK的白細(xì)胞介素-10(IL-10)的變化。探討減輕SAP中所致的腦損害,從而達(dá)到阻斷或減輕大鼠PE發(fā)生過程,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。對(duì)照組,神經(jīng)髓鞘結(jié)構(gòu)藍(lán)色變淡,髓鞘結(jié)構(gòu)不連續(xù),脫髓鞘。CsA治療組,接近于正常神經(jīng)髓鞘結(jié)構(gòu),神經(jīng)髓鞘染為連續(xù)鮮藍(lán)色結(jié)構(gòu)。1材料和方法1.1動(dòng)物造模制備Wistar雄性大白鼠60只,體重200～260g,雌雄不拘,隨機(jī)分為對(duì)照組(n=30)CsA治療組(n=30)兩組大鼠。各組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前12h禁食,自由飲水。參照苗毅等從頸內(nèi)動(dòng)脈注入PLA2復(fù)制大鼠PE模型。1%氯氨酮(1mL/100g)腹腔注射麻醉,由頸內(nèi)動(dòng)脈注入藥物PLA2(0.1mL/100g,1000u/0.1mL。速度為0.05mL/min)制模。CsA治療組在造模前5min腹腔注射CsA(30mg/kg),之后每天同時(shí)間腹腔注射CsA(30mg/kg),直至處死。對(duì)照組用等容積生理鹽水代替。1.2鼠腦的切調(diào)查處死方法:1%氯氨酮(1mL/100g)腹腔注射麻醉后,腹主動(dòng)脈放血處死。對(duì)照組和CsA治療組分別于造模后1d、3d及7d各處死動(dòng)物10只。取腦:十字切開鼠頭皮膚,咬骨鉗咬去顱骨,利用腦的自重下墜,剪去顱底神經(jīng),完整取下鼠腦。沿中線將鼠腦切開,右側(cè)一半放入4%甲醛中固定保存,其中切取額葉少許白質(zhì)放入4%戊二醛中固定保存。另一半垂直于中線的方向切成二份,額葉制備組織勻漿,枕葉用于測(cè)定腦組織的干濕重比。對(duì)照組,髓鞘的正常紋理不清,結(jié)構(gòu)紊亂。髓鞘變形,厚薄不一,有的增生增厚,突向軸漿,有的松解、破碎,斷裂呈多層狀、空泡狀、空網(wǎng)狀改變,出現(xiàn)脫髓鞘化。CsA治療組,尚可辨別髓鞘的致密板層結(jié)構(gòu),髓鞘變形、松解、破碎等改變輕微。1.3樣品采集(1)腦水分析腦組織含水量=(濕重-干重)÷濕重×100%。(2)樣品腦組織的均勻糊精制備按重量和冰蒸餾水體積的比(W/V)為1∶4制備20%的勻漿。(3)組織社會(huì)學(xué)檢查腦組織額葉常規(guī)病理切片,髓鞘特殊染色,光鏡及電鏡下觀察中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘改變。(4)砂羅鉻花綠法髓鞘特殊染色,操作按說明書進(jìn)行。(5)用il-10檢測(cè)腦組織tnf-、il-10腦組織勻漿TNF-α,IL-10測(cè)定用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定,試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn),操作按說明書進(jìn)行。1.4統(tǒng)計(jì)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)采用SPSSl1.0軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。2結(jié)果2.1反射、反應(yīng)遲軌道交通對(duì)照組大鼠表現(xiàn)為厭食,嗜睡,肌張力下降,活動(dòng)減少,反應(yīng)遲鈍,抓捕反射減弱;CsA治療組大鼠進(jìn)食、活動(dòng)、反應(yīng)、抓捕反射均較對(duì)照組大鼠有不同程度改善。2.2兩組脫髓冠朝情況比較砂羅鉻花青法。對(duì)照組第1d脫髓鞘改變不明顯,從第3d開始出現(xiàn)脫髓鞘改變,第7d最為明顯。而CsA治療組脫髓鞘改變輕微。圖1為低倍光鏡觀察,圖2為電鏡觀察。2.3各組大鼠腦tnf-和組織含水量比較(1)CsA治療組大鼠腦組織IL-10水平表達(dá)均較對(duì)照組大鼠腦組織升高(P<0.05),對(duì)照組大鼠腦組織IL-10表達(dá)水平也升高,但組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CsA治療組間比較:CsA治療組間第3d,第7d與第1d比較均顯著升高(P<0.01),與第3d比較,第7dIL-10水平表達(dá)顯著升高(P<0.01)(見表1)。(2)CsA治療組大鼠腦組織TNF-α水平表達(dá)均較對(duì)照組大鼠腦組織降低(P<0.05)。對(duì)照組大鼠腦組織TNF-α表達(dá)水平升高,但組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CsA治療組間比較:CsA治療組大鼠腦組織第3d,第7d與第1d比較均降低(P<0.05)、與第3d比較,第7d腦組織TNF-α水平表達(dá)顯著降低(P<0.01)(見表2)。(3)CsA治療組大鼠腦組織含水量較對(duì)照組大鼠腦組織含水量降低(P<0.05)。對(duì)照組大鼠腦組織含水量表達(dá)水平升高,但組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CsA治療組間比較:CsA治療組大鼠腦組織含水量第3d,第7d與第1d比較均降低(P<0.05)、與第3d比較,第7d腦組織含水量顯著降低(P<0.01)(見表3)。3免疫抑制作用PE預(yù)防治療的關(guān)鍵仍在于對(duì)原發(fā)病SAP的處理上,基于循證醫(yī)學(xué)指導(dǎo)下的治療策略的轉(zhuǎn)變。隨著SAP治療結(jié)果的改善,PE的發(fā)病率和病死率明顯下降。而AP本身的治療也逐漸轉(zhuǎn)移到全身的炎癥反應(yīng)上來。細(xì)胞因子和炎癥反應(yīng)失衡理論在SAP發(fā)病機(jī)制中的重要地位現(xiàn)已得到公認(rèn),炎癥和抗炎反應(yīng)的平衡使機(jī)體既能有效抵御致病因素的侵襲,又使炎癥反應(yīng)不至過于強(qiáng)烈而損傷機(jī)體器官正常功能。但在AP的情況下,這種平衡遭到破壞,炎癥反應(yīng)失控,CK大量釋放,導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng),進(jìn)而損傷多器官功能。這種失衡還表現(xiàn)為繼發(fā)抗炎反應(yīng)過度亢進(jìn),下調(diào)CK的產(chǎn)生,拮抗其作用,影響免疫細(xì)胞的功能,造成代償性抗炎反應(yīng)綜合征(CARS)。Th1/Th2的變化能夠反映機(jī)體促炎和抗炎反應(yīng)的失衡狀況。代表Th1的TNF-α在促炎因子中起核心作用,而代表Th2的IL-10是抗炎因子中的關(guān)鍵因子,目前認(rèn)為TNF-α是導(dǎo)致胰腺及胰外器官組織釋放其他炎癥介質(zhì)及CK的重要啟動(dòng)因子,它與AP的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。TNF-α/IL-10的變化反映了Th1/Th2的功能變化,在AP病程中有由促炎反應(yīng)向抗炎反應(yīng)即免疫亢進(jìn)向免疫抑制轉(zhuǎn)化的趨勢(shì),反映了在ANP病程中有Th1向Th2漂移的傾向。CsA作為一種T淋巴細(xì)胞功能調(diào)節(jié)藥,可特異性地抑制輔助性T淋巴細(xì)胞活性(Th);抑制T淋巴細(xì)胞分泌IL-2,對(duì)其他免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、T細(xì)胞依賴性B細(xì)胞)的功能和細(xì)胞因子[如IL-4、IL-5、IL-6、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、TNF-β、γ干擾素(IFN-γ)]等的分泌也有一定抑制作用。而對(duì)Th2型抑制性細(xì)胞因子IL-10,卻能促進(jìn)分泌。本實(shí)驗(yàn)中CsA治療組腦組織勻漿TNF-α的水平較對(duì)照組明顯下降,而IL-10則較對(duì)照組明顯升高。因此,人為地促使Thl向Th2:轉(zhuǎn)化,調(diào)整Thl/Th2的平衡可能是AP免疫干預(yù)治療的措施之一,如果PE的自身免疫理論得到證實(shí),那么,CsA強(qiáng)大的免疫抑制作用必將對(duì)PE的治療提供一個(gè)新思路。眾多研究表明,在細(xì)胞因子中,TNF-α是胰腺炎最早升高的細(xì)胞因子,起核心作用,TNF-α介導(dǎo)腦組織損害的作用機(jī)制可能與以下幾個(gè)方面有關(guān):(1)TNF-α可刺激PLA2的分化,也可直接激活PLA2;(2)TNF-α可激活白細(xì)胞并導(dǎo)致白細(xì)胞積聚,激活的白細(xì)胞可釋放增強(qiáng)毛細(xì)血管通透性的炎性介質(zhì),炎性介質(zhì)又可正反饋促進(jìn)TNF一α等細(xì)胞因子產(chǎn)生,從而形成“瀑布”樣級(jí)聯(lián)反應(yīng);(3)TNF-α既可直接誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性增加,也可間接通過白細(xì)胞發(fā)揮作用;(4)TNF-α對(duì)血管內(nèi)皮的黏附分子如ELAM—l和ICAM—l有向上調(diào)節(jié)作用,黏附分子向上調(diào)節(jié)可促進(jìn)白細(xì)胞的黏附和收縮,造成毛細(xì)血管滲漏和組織損害;(5)TNF-α介導(dǎo)髓鞘的炎性損傷,刺激免疫細(xì)胞活化,造成對(duì)髓鞘的破壞,也可直接對(duì)髓鞘產(chǎn)生毒性破壞作用;(6)刺激血小板活化因子(PAF)生成,促使血小板聚集及釋放反應(yīng),誘導(dǎo)腦微血管血栓形成及內(nèi)皮細(xì)胞的破壞。IL-10具有抑制炎癥維持細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡的負(fù)調(diào)控作用已被眾多學(xué)者所公認(rèn),由Th2細(xì)胞分泌,IL-10通過下調(diào)單核/巨噬細(xì)胞MHC-II類抗原的表達(dá),不僅抑制經(jīng)LPS激活下前炎癥性細(xì)胞因子TNF-α的產(chǎn)生,并抑制了Thl細(xì)胞的活化及其IL-1β以及單核細(xì)胞等IL-6,IL-8的合成,且對(duì)LPS誘導(dǎo)下NO、血小板活化因子(PAF)等休克介質(zhì)的產(chǎn)生也有下調(diào)作用,并證實(shí)IL-10具有對(duì)LPS敗血癥休克致死持久的抑制作用,能促使IL-1受體拮抗劑(IL-Ira)的表達(dá),在體內(nèi)外均證實(shí)具有抑制Thl介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。IL-10mRNA的合成又可通過IL-10自調(diào)作用被抑制,這在Th1/Th2的平衡調(diào)節(jié)中具有重要作用。因此,IL-10是維持細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的負(fù)調(diào)節(jié)劑,并具有重要的臨床治療價(jià)值。CsA能選擇性地抑制代表Th1的TNF-α,而對(duì)代表Th2的IL-10則有升高作用,促進(jìn)SAP病程中Thl向Th2的漂移,從而促進(jìn)AP的治愈。說明CsA可作為Th1向Th2轉(zhuǎn)換的免疫調(diào)節(jié)劑,以拮抗Th1產(chǎn)生的前炎癥性介質(zhì)所介導(dǎo)的炎癥作用,阻止AP由局部向SAP和MODS、PE發(fā)展,可試用于AP、PE的實(shí)驗(yàn)性治療。而介導(dǎo)脫髓鞘病變的主要細(xì)胞CD+4(Th1)細(xì)胞,CsA對(duì)輔助性T淋巴細(xì)胞的抑制作用,使本實(shí)驗(yàn)中的CsA治療組脫髓鞘改變輕微,而對(duì)照組中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘改變明顯。4csa治療il-10對(duì)大鼠腦膠質(zhì)瘤組織形態(tài)的影響本研究主要