通心絡(luò)對雞胚絨尿囊膜血管生成作用的影響

通心絡(luò)對雞胚絨尿囊膜血管生成作用的影響

冠狀動脈狹窄或狹窄的冠狀動脈容易出血，這通常影響著心血管疾病的臨床癥狀。近年來，冠狀動脈內(nèi)動脈旁路置換科（cabg）、經(jīng)皮動脈內(nèi)血管成形術(shù)（ptca）和心肌內(nèi)激光穿孔等新技術(shù)的發(fā)展取得了一定的療效，但一些患者的藥物治療效果不佳，不適合血管置換術(shù)。即使術(shù)后出現(xiàn)25%50%的再狹窄率，用血管置換術(shù)的抗心力衰竭作用也逐漸成為研究的重點。血管新生療法是通過加強新側(cè)血管的自然過程來維持動脈逐漸開放時的血流量。在本研究中，我們計劃通過雞囊腔毛尿囊膜模型（com）模型來探討中醫(yī)通心絡(luò)對血管生成的影響。1材料和方法1.1模型準(zhǔn)備香港麻花雞胚蛋,蛋重50～65g,由上海滬廣家禽育種有限公司提供。1.2試劑甲醇(國產(chǎn)分析純),丙酮(國產(chǎn)分析純),孔徑0.45μm的微孔濾膜(上海華美生物工程公司)。1.3解剖顯微、電子天平培養(yǎng)箱(日本池本理化工業(yè)株式會社),超凈工作臺(上海凈化設(shè)備廠),解剖顯微鏡(日本Olympus公司320040型),電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司JY2002型)。1.4特效藥1.4.1通心絡(luò)藥粉由河北以嶺藥業(yè)有限公司提供,主要由人參、水蛭、全蝎等組成,以蒸餾水配制成1g/ml藥液。1.4.2灌胃劑量對大劑量大劑量組的影響普通級雄性Wistar大鼠,體重(220±20)g,常規(guī)喂養(yǎng)。通心絡(luò)小劑量及大劑量組分別按成人(50kg)公斤體重劑量的5倍、10倍量灌胃,空白組給予與大劑量通心絡(luò)組相同體積的生理鹽水。按文獻(xiàn)報道的方法分別制成大、小劑量通心絡(luò)及空白血清,分裝后-30℃保存,經(jīng)培養(yǎng)實驗證明無微生物污染后使用。1.4.3重組革質(zhì)化細(xì)胞生長因子bfgf由珠海東大生物制藥有限公司生產(chǎn)(商品名“貝復(fù)濟”),批號(98)衛(wèi)藥準(zhǔn)字(珠東大)S-01號。1.5透明膜的制備參照付生法、姜志鋼等報道的方法略加改進(jìn)。白皮種蛋消毒后放入37℃孵化箱,氣室向上,每天轉(zhuǎn)動3～4次,至孵蛋第9天,消毒種蛋表面后在氣室頂端打1～2mm小孔,在距胎頭前1cm、2條前卵黃靜脈之間的卵殼投影部位標(biāo)記1.1cm×1.5cm的長方形區(qū)域,磨切透卵殼,在卵殼膜上輕輕劃破直徑約1mm的小孔,滴加少許無菌蒸餾水分離小孔邊緣的卵殼膜,將無菌的直徑為6mm的微孔濾膜載體放在CAM的血管最少處,然后在載體中央加各組相應(yīng)的藥液,加藥液量為每蛋10μl。加藥后,用無菌透明膠封窗,標(biāo)記后再放入37.8℃的孵箱內(nèi)孵育3d。加藥3d后,每蛋注入1∶1的甲醇、丙酮等量混合固定液2.5ml,室溫下固定20min,待CAM上血管內(nèi)的血液凝固后,揭去封窗的透明膜,剪除CAM水平以上的蛋殼,以濾膜載體從中心把CAM剪下,放入盛有少量水并鋪有濾紙的平皿里展開,陰干,連同濾紙保存。解剖顯微鏡下以相同放大倍數(shù)計數(shù)血管,以實驗部位邊緣(即微孔濾膜載體邊緣)1mm范圍內(nèi)為一級血管,以實驗部位邊緣5mm處為二級血管,凡屬趨向性生長的血管,即為載體從中心發(fā)出,與濾膜半徑的夾角小于45度者均予計數(shù),而穿行、繞行的血管則不算在內(nèi)。一、二級血管分別觀察計數(shù)。1.6統(tǒng)計處理所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,應(yīng)用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析比較各組間差異。2各組血管生成數(shù)的比較通心絡(luò)對雞胚絨毛尿囊膜一級、二級血管生成的影響見表1和圖1～4(封三)。如表1所示,與空白血清組相比,貝復(fù)濟組及通心絡(luò)大劑量組血管生成數(shù)明顯增加(P<0.05),且通心絡(luò)大劑量組與貝復(fù)濟組無明顯差別(P>0.05),但通心絡(luò)小劑量組的血管生成數(shù)則明顯少于貝復(fù)濟組(P<0.05),提示通心絡(luò)有促進(jìn)血管生成的作用且呈劑量依賴性。3討論3.1中藥復(fù)方制劑與體內(nèi)實驗設(shè)計的比較,有利于藥物在體內(nèi)進(jìn)行體外實驗和以推動藥單味中藥作為天然藥物本身成分就很復(fù)雜,而中藥復(fù)方則更是所組成藥物的有機組合,體現(xiàn)的是一種綜合作用,且藥物進(jìn)入體內(nèi)后還會發(fā)生一系列的代謝變化,中藥粗制劑直接加入離體反應(yīng)體系中并不能顯示藥物在體內(nèi)的代謝過程,因此中藥復(fù)方藥理的體外研究往往和體內(nèi)實驗存在一定的差距,而使中藥經(jīng)口服吸收后用含藥血清進(jìn)行體外實驗,可以更真實地體現(xiàn)藥物在體內(nèi)代謝后的作用。本實驗中,由于通心絡(luò)粉末極難溶于水,因此我們采用血清藥理學(xué)的方法既解決了水溶性的問題,又能最大程度地模擬藥物經(jīng)體內(nèi)代謝后的作用,從而使所得結(jié)果基本與臨床相一致。3.2冠血流動的生物活性物質(zhì)及相關(guān)問題血管新生即原有的血管又產(chǎn)生新的血管,生理情況下血管生長處于相對平衡狀態(tài),當(dāng)發(fā)生缺血缺氧及腫瘤等應(yīng)激情況時平衡失控,血管新生的過程被激活,導(dǎo)致側(cè)枝血管形成。以往對冠心病發(fā)展過程中冠狀動脈側(cè)枝循環(huán)的研究主要集中在壓力梯度及血流量等物理因素,而目前研究發(fā)現(xiàn)在心肌缺血缺氧時,冠脈側(cè)枝的形成可以減少或抵御心肌缺血或壞死,保證血液的正常供給,而其中成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)的信使核糖核酸(mRNA)表達(dá)明顯增多,說明側(cè)枝循環(huán)的建立可能與具有生物活性物質(zhì)的作用有關(guān),但是目前采用促血管新生因子治療冠心病還處于臨床實驗階段,還有諸如給藥途徑、起效時間及安全性等問題有待解決。3.3對血管的作用近年來已建立了多種實驗?zāi)Ｐ鸵詸z測生物或物理機械因素對側(cè)枝循環(huán)形成的干預(yù)作用,包括對犬、豬等大動物進(jìn)行直接心臟部位的血管計數(shù),或通過雞胚尿囊膜、動物頰囊膜等的血管生長對反映促血管新生作用的強弱,其中雞胚尿囊膜由于模型簡便易行,計數(shù)指標(biāo)客觀成熟并具有良好的重復(fù)性,可定性定量地檢測不同組織或細(xì)胞系分泌成分及生物因子等對血管的作用,從而廣泛應(yīng)用于中藥的血管生成活性及作用特點的研究。3.4氣養(yǎng)血氣,陰血清氣之風(fēng)通心絡(luò)是依據(jù)中醫(yī)絡(luò)病理論研制的治療冠心病的復(fù)方制劑,由人參、水蛭、全蝎、蜈蚣、赤芍等組成,以