甘薯糖蛋白的分離純化

甘薯糖蛋白的分離純化微生物09301班第七小組程蒙董雨葉雷崔德1糖蛋白的介紹2甘薯糖蛋白的分離純化及鑒定34內(nèi)容結(jié)果分析及結(jié)論小結(jié)1908年美國(guó)生物化學(xué)家協(xié)會(huì)的蛋白質(zhì)命名委員會(huì)首次將糖蛋白定義為:由蛋白質(zhì)分子和除核酸外的包含有碳水化合物基團(tuán)的物質(zhì)共同組成的一類復(fù)合物?，F(xiàn)已將蛋白聚糖從糖蛋白中劃分出來(lái)，而專指由比較短且往往具分支的寡糖鏈與蛋白質(zhì)(多肽鏈)共價(jià)相連而構(gòu)成的糖復(fù)合物。一，糖蛋白的介紹甘薯糖蛋白SPG-1是一具O-型糖肽鍵的糖蛋白，所以其中的糖鏈SPG小P可在堿性條件下釋放，所釋放的糖鏈能被NaBH4場(chǎng)還原成對(duì)堿穩(wěn)定的糖醇，而SPG-1中的蛋白質(zhì)(肽鏈)也可部份被堿性降解為低聚肽和氨基酸其糖鏈也有可能被部分降解為低聚糖和單糖。SPG-1-P的一級(jí)結(jié)構(gòu)是一種由葡萄糖形成的均多糖，為中性多糖。SPG-1-P主要是以α-型糖苷鍵連接的，糖環(huán)為毗喃型。甲基化反應(yīng)證明SPG-1-P是以α-1，6-連接的葡聚糖。

糖鏈結(jié)構(gòu)甘薯糖蛋白日本營(yíng)養(yǎng)學(xué)家發(fā)現(xiàn),甘薯含有豐富的粘液蛋白,這是一種多糖與蛋白質(zhì)結(jié)合的糖蛋白,對(duì)人體有特殊的保護(hù)作用,能保持消化道、呼吸道、關(guān)節(jié)腔、膜腔的潤(rùn)滑和血管的彈性,由于這種物質(zhì)可防止脂類物質(zhì)在動(dòng)脈管壁上沉積而引起的動(dòng)脈硬化,防止肝及腎臟等器官結(jié)締組織的萎縮,可以減緩人體器官的老化,提高肌體免疫力。日本國(guó)力癌癥預(yù)防研究所通過實(shí)驗(yàn)證明,甘薯的抗癌效果在各種蔬菜中位居第1。我國(guó)是世界上甘薯生產(chǎn)第1大國(guó),在甘薯淀粉生產(chǎn)過程中會(huì)產(chǎn)生大量的廢液，這其中就含有大量的甘薯糖蛋白。甘薯糖蛋白的組成甘薯粗糖蛋白經(jīng)過(NH4)2SO4分級(jí)沉淀和柱層析分離,得到SP-324組分,組成分析結(jié)果表明氨基酸組成中天冬氨酸含量最高,占總氨基酸總量的13.80%,能夠構(gòu)成O-糖肽鍵的絲氨酸和蘇氨酸分別占總量的6.05%和4.89%;其單糖主要含有葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖,其比例為12∶1∶1.14,并含有痕量的鼠李糖、木糖、甘露糖;SP-324組分是一種糖蛋白，其中蛋白含量74.00%,糖含量7.80%,而且SP-324組分中的糖和蛋白是以O(shè)-糖肽鍵連接到蘇氨酸上的甘薯糖蛋白的利用（１）國(guó)外甘薯食品的開發(fā)利用現(xiàn)狀目前，國(guó)外的甘薯食品有：

方便食品、快餐食品、方便半成品，如薯米(粒)、薯粉、薯面、脫水薯片(條、泥)；

休閑食品，如膨化薯片、薯脯等，這類食品具有味美、食用方便、包裝精美等特點(diǎn)；

其他，如甘薯飲料、甘薯罐頭、甘薯酒等i引。近年來(lái)，國(guó)外一些地區(qū)掀起了一陣甘薯食品熱，一些較大的食品廠竟相丌發(fā)甘薯食品，使這種普通的甘薯成為人們喜好的新潮食品。目前它己被制作成山芋餅、小甜餅、果子凍、冰淇淋、果子露，甘薯酸奶等多種保健食品和美容食品。（２）國(guó)內(nèi)甘薯食品的開發(fā)利用現(xiàn)狀國(guó)內(nèi)利用甘薯加工的食品有：甘薯脯、甘薯蜜餞、甘薯醬、薯糕、軟糖、罐頭、粉絲、粉條、粉皮、甘薯粉、多維面條、煎餅、雪糕、巧克力、膨化食品、脫水甘薯片、蝦味脆片、速煮甘薯、冷凍甘薯片、連城紅心薯干、香酥薯片、甘薯發(fā)糕、甘薯點(diǎn)心、甘薯黃酒掣。目前，香港己流行用甘薯葉制作名宴菜，菜市出售每kg甘薯葉價(jià)超過100港元，且貨源奇缺，經(jīng)常脫銷。用甘薯葉加工成的脫水菜、鹽漬菜，在日本、歐美、東南亞等地市場(chǎng)非常暢銷。我國(guó)福建省的永定、新羅、安溪、永春等地及廣東省一些地區(qū)，也常以甘薯葉作為夏季蔬菜。甘薯葉食用方法簡(jiǎn)單，取幼嫩的葉片與葉柄(撕去表皮)，經(jīng)開水燙熟后，佐以香油等調(diào)料即可入肴，也可加調(diào)料爆炒。二，甘薯糖蛋白的分離純化及鑒定1.材料和儀器材料：甘薯、DEAE-52纖維素、SephadexG-100、無(wú)水乙醇、Sevag試劑（氯仿、正丁醇）、碳酸氫鈉溶液、0.02mol/LTris-HCl、透析袋、牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、Folin-酚試劑、硫酸-苯酚試劑、正丙醇、濃氨水、水、0.5%甲苯胺藍(lán)乙醇溶液、考馬斯亮藍(lán)R250、Tris-Gly-SDS溶液等儀器：紫外可見分光光度計(jì)、SDS-PACE電泳儀、自動(dòng)部分收集器、冷凍真空干燥器、離心機(jī)、層析系統(tǒng)、ZK-82A真空干燥箱2.甘薯粗糖蛋白提取的工藝路線為：

甘薯粉一熱水浸提一抽濾得到浸提液一浸提液真空濃縮一醇析過夜一離心棄上清一少量水溶解一Sevag法去除游離蛋白一離心一取水層透析一透析內(nèi)液醇析過夜一離心一沉淀真空干燥一甘薯粗糖蛋白，3.分離和純化的操作步驟(1)稱取的甘薯在60℃下烘干并粉碎，加適量（4～6倍）水浸取3次，每次0.5～1h。(2)合并浸取液，離心，上清液加無(wú)水乙醇沉淀蛋白，離心后分離出沉淀。(3)所得沉淀物用適量蒸餾水溶解，再加入氯仿：正丁醇=4:1(V/V）的Sevag試劑，以充分去除脂質(zhì)、游離蛋白質(zhì)，然后樣液取水層透析，收集透析袋內(nèi)液，離心（4500r/min）30min，取上清液，真空干燥后即得甘薯糖蛋白粗品（淡黃色粉末）(4)甘薯糖蛋白粗品依次經(jīng)DEAE-纖維素52柱層析(1.6cmx20cm)，分別用0.05,0.1,0.5mol/L的碳酸氫鈉溶液分階段洗脫，收集洗脫液。(5)洗脫液在經(jīng)過SephadexG-100柱層析(1.6cmx80cm),用0.02mol/LTris-HCL(pH7.2)洗脫，收集洗脫液X

4甘薯糖蛋白純度的鑒定(1)紙色譜對(duì)甘薯糖蛋白的純度鑒定經(jīng)DEAE-52和SephadexG-100柱層析的甘薯糖蛋白純品物質(zhì),溶解于一定體積水后點(diǎn)樣進(jìn)行紙色譜，經(jīng)大量預(yù)備實(shí)驗(yàn)，確定出較好的展開劑為正丙醇：濃氨水：水=40：60：5,顯色劑為0．5％甲苯胺藍(lán)乙醇溶液。層析結(jié)果可以看出，經(jīng)DEAE-52和SephadexG-100柱層析精制后的甘薯糖蛋白純品僅出現(xiàn)一個(gè)斑點(diǎn)，Rf值為0．64，而洗脫前的甘薯糖蛋白粗品在原點(diǎn)處尚有一個(gè)斑點(diǎn)。(2)SDS一聚丙烯酰胺凝膠(SDS—PAGE)電泳對(duì)甘薯糖蛋白的純度鑒定甘薯糖蛋白粗品和經(jīng)DEAE-52柱層析、SephadexG-100柱層析后的甘薯糖蛋白純品同時(shí)進(jìn)行SDS一聚丙烯酞胺凝膠電泳，分離膠濃度為15％，濃縮膠濃度為6％，電極緩沖液為pH8．3的Tris—Gly—SDS溶液，用考馬斯亮蘭R250染色，脫色液為7％冰乙酸。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)如圖１、圖２，甘薯糖蛋白粗品經(jīng)電泳后，有兩條染色帶，而甘薯糖蛋白純品只有唯一的一條帶，可以證明甘薯糖蛋白純品已經(jīng)得到純化。圖１甘薯糖蛋白粗品

圖２甘薯糖蛋白純品

SDS—PAGE電泳圖

SDS—PAGE電泳圖

５甘薯糖蛋白含量的測(cè)定甘薯糖蛋白以苯酚一硫酸法測(cè)定其糖含量，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品；以F01in一酚試劑法測(cè)定其蛋白質(zhì)含量，以牛血清清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)280nm和490nm下分別比色測(cè)定，按上述提取純化流程1009鮮甘薯(重復(fù)三次)，經(jīng)溶劑提取得到甘薯糖蛋白粗品，干燥至恒重為0．47119，得率為0．47％，再經(jīng)DEAE一52和SephadexG—100柱層析后的甘薯糖蛋白純品，干燥至恒重為O．38569甘薯糖蛋白純品，得率為0．39％。三、結(jié)果分析及結(jié)論１．甘薯糖蛋白提取料液比及時(shí)間的確定２．甘薯糖蛋白提取沉淀試劑的選擇３．透析對(duì)甘薯糖蛋白提取率的影響４．甘薯糖蛋白的純化５．結(jié)論從圖可以看出，隨溶劑體積的增加和提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率逐漸增大。當(dāng)提取溶劑大于6倍樣品體積和提取時(shí)間大于lh后，提取率