植物DNA的提取與測(cè)定

植物DNA的提取與測(cè)定一、 目的隨著基因工程等分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展及廣泛應(yīng)用，人們經(jīng)常需要提取高分子量的植物DNA，用于構(gòu)建基因文庫、基因組southern分析、酶切及克隆等，這是研究基因結(jié)構(gòu)和功能的重要步驟。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍W(xué)習(xí)從植物材料中提取和測(cè)定DNA的原理并掌握CTAB提取DNA的方法，進(jìn)一步了解DNA的性質(zhì)。二、 原理細(xì)胞中的DNA絕大多數(shù)以DNA-蛋白復(fù)合物（DNP）的形式存在于細(xì)胞核內(nèi)。提取DNA時(shí)，一般先破碎細(xì)胞釋放出DNP，再用含少量異戊醇的氯仿除去蛋白質(zhì)，最后用乙醇把DNA從抽提液中沉淀出來。DNP與核糖核蛋白（RNP）在不同濃度的電解質(zhì)溶液中溶解度差別很大，利用這一特性可將二者分離。以NaCl溶液為例：RNP在0.14mol/LNaCl中溶解度很大，而DNP在其中的溶解度僅為純水中的1%。當(dāng)NaCl濃度逐漸增大時(shí)，RNP的溶解度變化不大，而DNP的溶解則隨之不斷增加。當(dāng)NaCl濃度大于1mol/L時(shí)，DNP的溶解度最大，為純水中溶解度的2倍，因此通?？捎?.4mol/LNaCl提取DNA。為了得到純的DNA制品，可用適量的RNase處理提取液，以降解DNA中攙雜的RNA。關(guān)于植物總DNA的提取主要有兩種方法：CTAB法：CTAB（十六烷基三甲基漠化銨， hexadecyltrimethylammoniumbromide,簡(jiǎn)稱CTAB）：是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，它能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，當(dāng)降低溶液鹽的濃度到一定程度（0.3mol/LNaCl）時(shí)從溶液中沉淀，通過離心就可將CTAB與核酸的復(fù)合物同蛋白、多糖類物質(zhì)分開，然后將CTAB與核酸的復(fù)合物沉淀溶解于高鹽溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。SDS法：利用高濃度的陰離子去垢劑SDS（十二烷基磺酸鈉，Sodiumdodecylsulfate,簡(jiǎn)稱SDS）使DNA與蛋白質(zhì)分離，在高溫（55?65°C）條件下裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸，然后采用提高鹽濃度及降低溫度的方法使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物體的基因組DNA為107~109bp，在基因克隆工作中，通常要求制備的大分子DNA的分子量為克隆片段長(zhǎng)度的4倍以上，否則會(huì)由于制備過程中隨機(jī)斷裂的末端多為平末端，導(dǎo)致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，嚴(yán)重影響克隆工作。因此有效制備大分子DNA的方法必須考慮兩個(gè)原則：（1）盡量去除蛋白質(zhì)、RNA、次生代謝物質(zhì)（如多酚、類黃酮等）、多糖等雜質(zhì)，并防止和抑制內(nèi)源DNase對(duì)DNA的降解。（2）盡量減少對(duì)溶液中DNA的機(jī)械剪切破壞。幾乎所有的DNase都需要Mg2+或Mn2+為輔因子，故實(shí)現(xiàn)（1）盡量去除蛋白質(zhì)的要求，需加入一定濃度的螯合劑，如EDTA、檸檬酸，而且整個(gè)提取過程應(yīng)在較低溫度下進(jìn)行（一般利用液氮或冰?。?。為實(shí)現(xiàn)（2）需要在DNA處于溶解狀態(tài)時(shí)，盡量減弱溶液的渦旋，而且動(dòng)作要輕柔，在進(jìn)行DNA溶液轉(zhuǎn)移時(shí)用大口（或剪口）吸管。提取的DNA是否為純凈、雙鏈、高分子的化合物，一般要通過紫外吸收、化學(xué)測(cè)定、“熔點(diǎn)〃（meltingtemperature,Tm）測(cè)定、電鏡觀察及電泳分離等方法鑒定。本實(shí)驗(yàn)采用CTAB法提取DNA并通過紫外吸收法鑒定。三、實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器和試劑實(shí)驗(yàn)材料新鮮菠菜幼嫩組織、花椰菜花冠或小麥黃化苗等主要儀器高速冷凍離心機(jī)751型分光光度計(jì)恒溫水浴液氮或冰浴設(shè)備磨口錐形瓶核酸電泳設(shè)備試劑(CTAB法)CTAB提取緩沖液：100mmol/LTris-HCl(pH8.0),20mmol/LEDTA-Na2,1.4mol/LNaCl(如表1),2%CTAB,使用前加入0.1%(V/V)的8-巰基乙醇。表1CTAB提取緩沖液配制用HCl調(diào)pH值。TE緩沖液：10mmol/LTris-HCl,1mMEDTA(pH8.0)。DNase-freeRNaseA:溶解RNaseA于TE緩沖液中，濃度為10mg/mL,煮沸10?30min,除去DNase活性，一20°C貯存(DNase為DNA酶,Rnase為RNA酶)。氯仿-異戊醇混合液(24:1,V/V):240mL氯仿(A.R.)加10mL異戊醇(A.R.)混勻。3mol/L乙酸鈉(NaAc,pH6.8):稱取NaAc-3H2O81.62g,用蒸餾水溶解，配制成200mL,用HAc調(diào)pH至6.5。95%乙醇TE緩沖液，Tris-HCl(pH8.0)液，NaAc溶液均需要高壓滅菌。四、操作步驟稱取2?5g新鮮菠菜幼嫩組織或小麥黃花苗等植物材料，用自來水、蒸餾水先后沖洗葉面，用濾紙吸干水分備用。葉片稱重后剪成1cm長(zhǎng)，置研缽中，經(jīng)液氮冷凍后研磨成粉末。待液氮蒸發(fā)完后，加入15mL預(yù)熱(60?65C)的CTAB提取緩沖液，轉(zhuǎn)入一磨口錐形瓶中，置于65C水浴保溫，0.5~1h，不時(shí)地輕輕搖動(dòng)混勻。加等體積的氯仿/異戊醇(24:1)，蓋上瓶塞，溫和搖動(dòng)，使成乳狀液。將錐形瓶中的液體倒入離心管中，在室溫下4000r/min離心5min,靜置，離心管中出現(xiàn)3層，小心地吸取含有核酸的上層清液于量筒中，棄去中間層的細(xì)胞碎片和變性蛋白以及下層的氯仿。根據(jù)需要，上清液可用氯仿/異戊醇反復(fù)提取多次。收集上層清液，并將其倒入小燒杯。沿?zé)诼尤??2倍體積預(yù)冷的95%乙醇，邊加邊用細(xì)玻棒沿同一方向攪動(dòng)，可看到纖維狀的沉淀(主要為DNA)迅速纏繞在玻棒上。小心取下這些纖維狀沉淀，加1?2mL70%乙醇沖洗沉淀，輕搖幾分鐘，除去乙醇，即為DNA粗制品。上述DNA粗制品含有一定量的RNA和其它雜質(zhì)。若要制取較純的DNA，可將粗制品溶于TE緩沖液中，加入10mg/mL的RNase溶液，使其終濃度達(dá)50^g/mL，混合物于37°C水浴中保溫30min除去RNA。重復(fù)步驟2?5的操作，可制得較純的DNA制品。將DNA制品溶于250皿的TE緩沖液中，完全溶解DNA樣品。加入1/10倍體積的3mol/LNaAc（pH6.8）和2倍體積的95%乙醇，沉淀DNA，重復(fù)步驟5。最后，將DNA溶于250皿的TE緩沖液中。在751型分光光度計(jì)上測(cè)定該溶液在260nm紫外光波長(zhǎng)下的光密度值。代入下式計(jì)算DNA的含量。四、結(jié)果計(jì)算式中OD260nm為260nm處的光密度；L為比色杯光徑（cm）；0.020為1^g/mLDNA鈉鹽的光密度。DNA的紫外吸收高峰為260nm，吸收低峰為230nm，而蛋白質(zhì)的紫外吸收高峰為280nm。上述DNA溶液適當(dāng)稀釋后，在751分光光度計(jì)上測(cè)定其OD260nm、OD*nm和0。^“|^。如O^.nnm/OD*nm22OD肘nm/O^nnm>1.8，表示RNA230 280 260 230 260 280已經(jīng)除凈，蛋白含量不超過0.3%。五、 附注如果植物樣品不經(jīng)液氮處理，提取液中的CTAB濃度需要提高到4%（W/V）。在許多情況下，使用0.1%（V/V）巰基乙醇，并不能完全抑制葉片中的氧化作用，但是，這種氧化作用不會(huì)影響限制性內(nèi)切酶的活性。如果使用的巰基乙醇濃度高于0.1%（V/V），則會(huì)大大降低DNA的得率。六、 思考題制備的DNA在什么溶液中較穩(wěn)定？為了保證植物DNA的完整性，在吸取樣品、抽提過程中應(yīng)注意什么？參考答案制備的DNA在：（1）含有螯和劑如EDTA中較穩(wěn)定，因?yàn)镋DTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase；（2）在pH5?9之間較穩(wěn)定，否則過酸過堿會(huì)破壞DNA的結(jié)構(gòu)；（3）有一定離子強(qiáng)度（強(qiáng)度越高,DNA越穩(wěn)定）的溶液中較穩(wěn)定。（TE滿足以上要求，但如需對(duì)所得DNA進(jìn)行酶切,E