elisa測定的影響因素及操作要點

elisa測定的影響因素及操作要點

elisa是一種常用的固相酶免疫吸附試驗，是一種常見的固相酶免疫計量法。ELISA試驗以靈敏度較高、特異性較好的特點在臨床上得到了廣泛的應用,但ELISA測定中影響因素較多,而且其操作中有一定的技術(shù)要求,本文將從對ELISA測定中影響較明顯的標本及操作因素兩方面進行介紹。1樣品因素對elisa的影響1.1elisa系統(tǒng)中互聯(lián)反應型的檢測(1)類風濕因子:人血清中IgM、IgG型類風濕因子(RF)可以與ELISA系統(tǒng)中的捕獲抗體及酶標記二抗的FC段直接結(jié)合,從而導致假陽性。解決該情況的辦法是:檢測抗原時,可以用2-巰基乙醇等加入到標本稀釋液中,使RF降解。(2)補體:ELISA系統(tǒng)中固相一抗和標記二抗過程中,抗體分子發(fā)生變構(gòu),其FC段的補體C1q分子結(jié)合位點被暴露出來,使C1q可以將二者連接起來,從而造成假陽性。解決的辦法是:56℃,30min加熱血清使C1q滅活。(3)交叉反應物質(zhì):類地高辛、類AFP樣物質(zhì)等,是與靶抗原有交叉反應的物質(zhì)。在用多抗測定抗原時對測定結(jié)果影響不大,但在用單克隆抗體測定抗原時,如果交叉抗原決定簇正好是所用單克隆抗體相對應的靶決定簇時,也會出現(xiàn)假陽性結(jié)果。(4)標本中其它成分的影響:血清脂質(zhì)過高、膽紅素、血紅蛋白及血液粘度過大等,均對ELISA測定結(jié)果有干擾作用。1.2elisa測定血清標本的干擾外源性物質(zhì)常常是由于用于ELISA測定的血標本的采集、貯存等不當所致。如標本溶血、標本被細菌污染、標本貯存過久、標本凝集不全和采血管中添加物等影響。(1)標本溶血:由于各種人為原因引起的標本溶血,均可因紅細胞破壞溶解時釋放出大量具有過氧化物酶活性的血紅蛋白,在以辣根過氧化物酶為標記的ELISA測定中,會導致非特異性顯色,干擾測定結(jié)果。為克服上述干擾作用,標本采集時必須注意避免溶血。(2)標本受細菌污染:因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶,因此,被細菌污染的標本同溶血標本一樣,亦可產(chǎn)生非特異性顯色而干擾測定結(jié)果。(3)標本保存不當:在冰箱中保存過久的標本,血清中IgG可聚合成多聚體、AFP可形成二聚體,在間接法ELISA測定中會導致本底過深、甚至造成假陽性;標本放置時間過長(如1d以上),有時抗原或抗體免疫活性減弱,亦可出現(xiàn)假陰性。為克服上述干擾,ELISA測定的血清標本宜為新鮮采集;如不能立即測定,5d內(nèi)測定的血清標本可存放于4℃,1周后測定的血清標本應低溫凍存;凍存后融解的標本,蛋白質(zhì)局部濃縮,分布不均,應充分混合后再測定,但混勻時應輕柔,不可強烈振蕩。(4)標本凝集不全:在沒有促凝劑和抗凝劑存在的情況下,正常血液采集后1/2～2h開始凝固,18～24h完全凝固。臨床檢驗工作中,有時為了爭取時間快速檢測,常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清,此時的血清中仍殘留部分纖維蛋白原,在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊,易造成假陽性結(jié)果;這類情況于次日復查時因血凝已完全,血清中不再有纖維蛋白原存在,故復查結(jié)果變?yōu)殛幮浴楸苊馍鲜龈蓴_作用,解決的辦法最好是血液標本采集后必須使其充分凝固后再分離血清,或標本采集時用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當?shù)拇倌齽?5)標本管中添加物質(zhì)的影響:抗凝劑(如肝素,EDTA)、酶抑制劑(如NaN3可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性)及快速分離血清的分離膠等均對ELISA測定有一定干擾作用。2操作因素對結(jié)果的影響2.1試劑準備從冰箱中取出的試驗用試劑應待其溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存。不然會影響結(jié)果。2.2加標本、加樣在ELISA中一般有3次加樣步聚,即加標本,加酶結(jié)合物,加底物。加樣時應將所加物加在LEISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出,不可產(chǎn)生氣泡。加標本一般用微量加樣器,按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標本應更換吸嘴,以免發(fā)生交叉污染,也可用一次性的定量塑料管加樣。有些測定(如間接法ELISA)需用稀釋的血清,可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液,再在其中加入血清標本,然后在微型震蕩器上震蕩1min以保證混和。2.3封片或加固孔壁ELISA方法的保溫最好在水浴條件下進行,以減少邊緣效應。浴溫時應貼封片或加蓋,防止標本或稀釋液蒸發(fā),吸附于孔壁;在室溫比較高的條件下,大批量加樣時最好使用多通道加樣器以減少孵育時間人為延長而導致非特異性結(jié)合緊附于反應孔周圍,難以清洗徹底現(xiàn)象。2.4非特異性吸附型干擾物洗板的制備洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟,但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA就是靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的,而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物。采用手工洗板,應防止孔與孔之間液體交叉;采用半自動洗板機洗板時,洗液量不足,導致洗板不徹底;洗板針堵塞,抽吸不完全;洗板不暢,導致洗板效果差;反應板過多造成洗板等待時間長。解決方法:保證洗液注滿各孔,洗板針暢通,洗完板后最好在吸水紙(選擇干凈、無或少塵的吸水材料)上輕輕拍干;合理安排,或多用幾臺洗板機。2.5影響判定結(jié)果的因素顯色劑配制后放置時間過長或使用過期顯色劑;加顯色劑時濺出孔