茶葉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞玻璃化法超低溫保存的初步研究

茶葉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞玻璃化法超低溫保存的初步研究

茶的葉子包括黃酮類(lèi)、堿性類(lèi)和其他重要的二級(jí)代謝物質(zhì)。它對(duì)人體具有重要的生理和健康作用，如抗過(guò)敏、腫瘤和抗衰老。這是世界上受歡迎的保健飲料。茶葉組織培養(yǎng)研究開(kāi)始于20世紀(jì)60年代末,在茶葉生物化學(xué)基礎(chǔ)研究中發(fā)揮了重要作用。作者經(jīng)過(guò)努力,篩選出高產(chǎn)兒茶素細(xì)胞系和低產(chǎn)兒茶素細(xì)胞系,為研究茶兒茶素生物合成奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。然而,長(zhǎng)期不斷的繼代培養(yǎng)往往會(huì)引起細(xì)胞染色體的結(jié)構(gòu)和數(shù)目變異,并導(dǎo)致組織和細(xì)胞的生活力、分化能力和次生代謝產(chǎn)物合成的改變。為了妥善保存優(yōu)良的細(xì)胞系,需要建立和發(fā)展茶組織培養(yǎng)物的超低溫保存技術(shù)。植物材料的超低溫保存主要有兩步法、包埋-脫水法和玻璃化法。其中玻璃化法超低溫保存,具有程序簡(jiǎn)化,設(shè)備要求簡(jiǎn)單,重復(fù)性和凍存效果好等優(yōu)點(diǎn),成為較理想的植物種質(zhì)資源保存方法。玻璃化法是由Sakai.A等建立的一種較為簡(jiǎn)單超低溫保存方法,近年來(lái)在對(duì)植物組織細(xì)胞離體系統(tǒng)保存方面應(yīng)用廣泛。目前,已有多種植物的器官、組織和細(xì)胞培養(yǎng)物的玻璃化保存獲得成功。如魔芋莖尖、山崳菜的分生組織、擬南芥懸浮細(xì)胞系、紅葉水杉的懸浮細(xì)胞、長(zhǎng)鞭紅景天懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和荔枝胚性愈傷組織等。但至今尚未有茶細(xì)胞系的超低溫保存研究報(bào)道。本文以茶懸浮培養(yǎng)細(xì)胞為研究對(duì)象,采用玻璃化法進(jìn)行超低溫保存,建立茶葉細(xì)胞超低溫保存體系,為茶細(xì)胞系保存提供了新的方式。1材料和方法1.1材料表面1.1.1細(xì)胞系的培養(yǎng)茶細(xì)胞系由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)翠園云南大葉種(C.sinensisvar.assami(China))較嫩的莖誘導(dǎo)篩選而來(lái)。細(xì)胞系在代號(hào)B1固體培養(yǎng)基(B5培養(yǎng)基+0.5mg/L2,4-D+0.1mg/LKT+0.8%(w/v)瓊脂+3%(w/v)蔗糖)上進(jìn)行繼代培養(yǎng)一年以上。挑選長(zhǎng)勢(shì)較好的細(xì)胞在B1液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),每周繼代一次,不斷剔除老化和長(zhǎng)勢(shì)不好的細(xì)胞團(tuán),繼代4~5次后,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。1.1.2培養(yǎng)基液的制備培養(yǎng)液B1:pH5.5的B5培養(yǎng)基,含0.5mg/L2,4-D、0.1mg/LKT和3%(w/v)蔗糖。預(yù)培養(yǎng)溶液B2:含6%(w/v)蔗糖pH5.5的B1培養(yǎng)液。100%PVS2溶液:含30%(w/v)甘油、15%(w/v)乙二醇、15%(w/v)DMSO、0.4moL/L蔗糖的B1培養(yǎng)液。60%PVS2溶液:按體積B1培養(yǎng)液:100%PVS2溶液=2:3稀釋。洗滌液B3:含1.2mol/L蔗糖的B1培養(yǎng)液。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1不同濃度pvs2茶細(xì)胞的培養(yǎng)主要冷凍流程為:預(yù)培養(yǎng)→裝載→脫水→冷凍→復(fù)溫→洗滌→恢復(fù)培養(yǎng)。玻璃化超低溫保存流程具體操作如下[15~19]:將茶細(xì)胞系轉(zhuǎn)移至B2培養(yǎng)液中預(yù)培養(yǎng)5天;超凈工作臺(tái)上,滅菌濾紙吸取細(xì)胞團(tuán)表面水后,切成直徑約0.4cm的細(xì)胞團(tuán),電子秤稱(chēng)取200mg,放入2mL冷凍管,并加入2mL60%PVS2溶液,冰浴下裝載20min;移出60%PVS2溶液后,加2mL100%PVS2溶液,于冰浴下脫水,每20min時(shí)換一次溶液;脫水40min后移出溶液,加入1mL100%PVS2溶液,立刻放入液氮中冷凍保存。保存結(jié)束后取出冷凍管,立刻投入40℃水浴中復(fù)溫,并不時(shí)搖動(dòng),待細(xì)胞恢復(fù)到正常色后,將冷凍管從水浴中取出;吸去100%PVS2溶液,加入2mLB3溶液洗滌30min,每10min換一次液,取復(fù)溫洗滌后的茶細(xì)胞接種于表面覆兩層濾紙的B1固體培養(yǎng)基上,培養(yǎng)24h后,更換一次濾紙和培養(yǎng)基,培養(yǎng)1周后,去除濾紙轉(zhuǎn)入B1固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為:黑暗、溫度(25±2)℃。1.2.2ttd的提取保存后的茶細(xì)胞采用改良的Towill和Mazur的氯化三苯四氮唑(TTC)法檢測(cè)活力,取冷凍洗滌后的茶細(xì)胞,濾紙吸去細(xì)胞團(tuán)表面水份,稱(chēng)取200mg,分別加入2.5mL0.4%的TTC試劑和pH7.0的0.1mol/L的磷酸緩沖液,在黑暗下于30℃放置4h后,倒掉TTC,用蒸餾水洗滌3次。再加入95%乙醇5mL于60℃水浴浸提30min,研磨,4000g離心5min,取上清液,在485nm處測(cè)吸收值,以吸收值高低表示茶細(xì)胞活力。茶懸浮培養(yǎng)細(xì)胞玻璃化保存存活率的計(jì)算:存活率=(處理后細(xì)胞活力×100%)/處理前細(xì)胞活力。1.2.3不同裝置和不同提取溫度對(duì)茶懸浮培養(yǎng)細(xì)胞存活率的影響預(yù)培養(yǎng)處理:將茶細(xì)胞移至預(yù)培養(yǎng)B2溶液中,分別預(yù)培養(yǎng)0、2、4、6、8、10d,比較不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)茶懸浮培養(yǎng)細(xì)胞存活率的影響。細(xì)胞存活率按1.2.2測(cè)定。裝載處理:取預(yù)培養(yǎng)6d后的細(xì)胞,放入2mL冷凍管,并加2mL60%玻璃化保護(hù)劑(PVS2),于冰浴中分別裝載處理0、20、40、60min,比較不同裝載處理對(duì)茶懸浮培養(yǎng)細(xì)胞存活率的影響。細(xì)胞存活率按1.2.2測(cè)定。脫水處理:取預(yù)培養(yǎng)6d,裝載處理20min后的細(xì)胞加入2mL預(yù)冷至0℃的100%PVS2溶液,冰浴下分別脫水處理0、20、40、60、80min,每20min更換一次100%PVS2溶液。比較不同脫水處理對(duì)茶懸浮培養(yǎng)細(xì)胞存活率的影響。細(xì)胞存活率按1.2.2測(cè)定。復(fù)溫處理:茶細(xì)胞在液氮中停留1h以上,取出冷凍管,分別于冰浴、30℃、40℃、50℃水浴復(fù)溫,比較不同復(fù)溫溫度對(duì)茶懸浮培養(yǎng)細(xì)胞存活率的影響。細(xì)胞存活率按1.2.2測(cè)定。步驟缺省:省去1.2.1中玻璃化冷凍保存程序中預(yù)培養(yǎng)、裝載、脫水、冷凍、洗滌中的某一步,檢測(cè)玻璃化保存程序中步驟缺省對(duì)茶懸浮培養(yǎng)細(xì)胞存活率的影響。細(xì)胞存活率按1.2.2的方法測(cè)定。以上每組處理重復(fù)三次,每次三組平行。1.2.4統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel2003和DPS3.01分析軟件處理。2結(jié)果與分析2.1氣調(diào)培養(yǎng)的測(cè)定細(xì)胞狀態(tài)是決定細(xì)胞玻璃化保存是否成功的關(guān)鍵,預(yù)培養(yǎng)處理中,增加培養(yǎng)基蔗糖濃度,具有減少胞內(nèi)自由水,誘導(dǎo)細(xì)胞生成抗寒物質(zhì)的作用,本文采用蔗糖高滲預(yù)培養(yǎng)處理,茶細(xì)胞在含6%蔗糖的B5液體培養(yǎng)內(nèi)培養(yǎng)數(shù)天。從圖1可以看出,預(yù)培養(yǎng)4d和6d時(shí)其細(xì)胞存活率最高,達(dá)70.21%和61.01%,與其它時(shí)間段細(xì)胞存活率相比差異顯著,預(yù)培養(yǎng)6d后則有部分細(xì)胞開(kāi)始褐化,培養(yǎng)液開(kāi)始混濁,細(xì)胞存活率下降。經(jīng)過(guò)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)表明,含6%蔗糖培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)最佳時(shí)間為4~6d。2.2不同藥物對(duì)玻璃化保護(hù)劑滲透效果的影響常用的裝載處理是采用低濃度玻璃化保護(hù)劑(60%PVS2溶液)在低溫下清潤(rùn)細(xì)胞。冷凍前裝載處理,一方面幫助提高玻璃化保護(hù)劑的滲透效果,避免由于滲透壓變化劇烈對(duì)材料造成損傷,另一方面提高細(xì)胞對(duì)低溫的適應(yīng)性。從圖2可以看出,60%PVS2溶液的裝載處理,可以顯著提高細(xì)胞存活率,與對(duì)照(裝載0min)相比差異顯著;但裝載時(shí)間超過(guò)20min,裝載時(shí)間對(duì)細(xì)胞存活率影響并不大,呈相對(duì)平穩(wěn)趨勢(shì)。2.3脫水處理不同時(shí)間pvs2細(xì)胞存活率超低溫保存中適當(dāng)?shù)拿撍浅晒Φ年P(guān)鍵,細(xì)胞在投入液氮快速冷凍前,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行充分脫水,可以提高玻璃化的形成能力,減小對(duì)細(xì)胞膜的傷害。處理時(shí)間太短,達(dá)不到預(yù)期效果;處理時(shí)間太長(zhǎng),又會(huì)毒害細(xì)胞。圖3所示,未經(jīng)100%PVS2溶液脫水處理其成活率只有29.40%,隨著100%PVS2溶液處理時(shí)間的逐漸延長(zhǎng),其玻璃化保存存活率提高明顯,至40min時(shí),達(dá)到65.45%,與0min和20min時(shí)存活率相比較,差異顯著,脫水處理60min時(shí),細(xì)胞存活率達(dá)最高,為75.45%,但與40min時(shí)相比并未達(dá)到顯著差異。當(dāng)超過(guò)60min,玻璃化保護(hù)劑100%PVS2溶液的負(fù)面效應(yīng)開(kāi)始顯現(xiàn)出來(lái),細(xì)胞存活率略有下降。2.4復(fù)溫解凍方式是否需要在茶細(xì)胞中解凍玻璃化凍存的材料在保存終止后,要求快速化凍,以防止由于次生結(jié)冰對(duì)組織細(xì)胞造成的傷害。結(jié)果表明(圖4)不同復(fù)溫方式對(duì)茶懸浮培養(yǎng)細(xì)胞存活率影響相差較大。冰浴慢速?gòu)?fù)溫后,細(xì)胞活力低下,存活率只有26.42%,隨著復(fù)溫溫度的升高,懸浮培養(yǎng)細(xì)胞玻璃化保存后細(xì)胞活力顯著上升。40℃和50℃水浴下解凍,茶細(xì)胞存活率均較高,分別為80.80%、78.38%。但考慮到50℃復(fù)溫溫度,愈傷組織若不及時(shí)拿出,易受到高溫?fù)p傷,實(shí)驗(yàn)可操作性低。因此,40℃水浴復(fù)溫解凍是茶懸浮培養(yǎng)細(xì)胞玻璃化法保存較好的復(fù)溫方式。由于細(xì)胞復(fù)溫過(guò)程應(yīng)盡量避免胞內(nèi)冰晶的形成,故融冰過(guò)程中必須充分振搖冷凍管,盡量使管內(nèi)細(xì)胞和保護(hù)劑受熱均勻,同步融化,避免次生結(jié)冰對(duì)組織細(xì)胞損傷。2.5不同保護(hù)劑對(duì)茶細(xì)胞存活率的影響為了檢測(cè)玻璃化完整程序步驟缺省對(duì)茶懸浮培養(yǎng)存活率的影響,本文對(duì)茶懸浮培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行以下七種處理(表1)。與經(jīng)過(guò)完整冷凍程序處理的細(xì)胞(Ⅶ)相比,不經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)(Ⅰ)、裝載(Ⅱ)、脫水(Ⅲ)、洗滌(Ⅵ)的細(xì)胞存活率明顯下降,差異均達(dá)到顯著差異,其中不經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)(Ⅰ)、脫水(Ⅲ)的細(xì)胞存活率達(dá)到了極顯著差異。Ⅳ號(hào)細(xì)胞經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)后沒(méi)有經(jīng)過(guò)裝載和脫水處理,其存活率只有14.40%,可見(jiàn)沒(méi)有脫水和冷凍保護(hù)劑的充分保護(hù),冷凍后的細(xì)胞難以成活。Ⅴ號(hào)細(xì)胞為冷凍與復(fù)溫步驟缺省,細(xì)胞沒(méi)有受到冷凍過(guò)程的傷害,細(xì)胞存活率高,為88.40%,但預(yù)培養(yǎng)、保護(hù)劑的脫水以及高濃度蔗糖洗滌對(duì)茶細(xì)胞有一定的損傷。綜上所述冷凍程序預(yù)培養(yǎng)、裝載、脫水處理以及洗滌都不可缺損,對(duì)茶懸浮培養(yǎng)細(xì)胞存活率影響顯著。2.6再生培養(yǎng)基的制備經(jīng)復(fù)溫洗滌后的茶細(xì)胞接種于表面覆兩層滅菌濾紙的正常繼代培養(yǎng)基上,恢復(fù)培養(yǎng)24h后更換一次,培養(yǎng)1周后,即可轉(zhuǎn)入正常培養(yǎng)。在恢復(fù)再培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn),由于冷凍程序步驟較多,容易引起菌類(lèi)污染,建議在恢復(fù)培養(yǎng)基中加入抗生素。另外,試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)TTC檢測(cè)有活性的細(xì)胞,并不一定能夠再生,只有約20%細(xì)胞團(tuán)能夠重新再生長(zhǎng)出愈傷組織。但是重新再生的細(xì)胞團(tuán),其增殖速率并未下降,再培養(yǎng)30d后細(xì)胞團(tuán)數(shù)目可以恢復(fù)到冷凍前(圖5)。3細(xì)胞團(tuán)的存活率受到限制冷凍保存前細(xì)胞的生理狀態(tài)是決定細(xì)胞冷凍效果的重要因素,分裂旺盛、胞質(zhì)濃、液泡小、活性高的細(xì)胞抗寒能力強(qiáng),HS查夫拉指出胞質(zhì)濃、液泡小,活性高的細(xì)胞抗凍強(qiáng),處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,進(jìn)行冷凍后能得到較高的存活率。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),在冷凍保存前對(duì)茶懸浮培養(yǎng)細(xì)胞系加速傳代是十分必要的,可能是通過(guò)加速傳代提高了分裂細(xì)胞的比例,從而增加了冷凍存活率。此外,由于結(jié)構(gòu)的差異,冷凍材料體積的大小以及緊密程度也會(huì)影響冷凍效果,植物小細(xì)胞團(tuán)在降溫和復(fù)溫下的行為既不同于復(fù)雜組織和器官,又不同于懸浮培養(yǎng)的單細(xì)胞。苗琦提到冷凍材料體積過(guò)大或過(guò)小,其冷凍保存效果均不好。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)外層細(xì)胞的存活率小于內(nèi)層,可能與細(xì)胞團(tuán)內(nèi)外受熱不均勻有關(guān)。均一升溫是目前玻璃化保存所面對(duì)的巨大困難之一,可能的解決方案就是改變目前簡(jiǎn)單的熱傳導(dǎo)升溫方式,已經(jīng)有一種利用微波電磁對(duì)大塊的組織進(jìn)行加熱復(fù)溫的報(bào)道,其優(yōu)點(diǎn)是升溫速度快,可以有效的抑制再結(jié)晶的出現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞團(tuán)大小進(jìn)行嚴(yán)格的篩選是冷凍處理的關(guān)鍵步驟之一(數(shù)據(jù)未列出)。目前,有多種冷凍保護(hù)劑成功用于植物材料的玻璃化保存,應(yīng)用最為廣泛,效果最好的是SakaiA在橙的珠心細(xì)胞超低溫玻璃化保存中所用的冷凍保護(hù)劑(PVS2溶液),但若材料直接暴露在PVS2溶液中,易受到高濃度PVS2的傷害。在脫水處理之前,用低濃度的保護(hù)劑裝載材料,可以有效的提高材料對(duì)脫水處理的耐受力和脫水帶來(lái)的機(jī)械損傷。薛慶善提到,冷凍保護(hù)劑PVS2溶液中DMSO對(duì)細(xì)胞有毒害作用,常溫下DMSO在對(duì)細(xì)胞的毒性作用較大,而低于4℃時(shí),其毒性作用大大減弱,且仍能以較快的速度滲透到細(xì)胞內(nèi)。故實(shí)驗(yàn)材料裝載處理和脫水處理溫度都不易過(guò)高,此外后續(xù)的洗滌和恢復(fù)培養(yǎng)都應(yīng)盡量去除殘留的保護(hù)劑,即使如此,經(jīng)凍存的材料還是會(huì)不可避免地受到保護(hù)劑不同程度的傷害。細(xì)胞存活率是目前廣泛