細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測

細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測編輯ppt細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死1細(xì)胞凋亡的流式檢測方法2流式檢測細(xì)胞凋亡面臨的問題3目錄編輯ppt1.1細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是指細(xì)胞基因調(diào)控的一種自主性的自殺現(xiàn)象?；蛘哒f在一定的生理或病理?xiàng)l件下，細(xì)胞遵循自身的程序，自我結(jié)束生命的死亡方式。程序性細(xì)胞死亡(ProgrammedCellDeath,PCD)細(xì)胞凋亡同細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化一樣，是機(jī)體生存和發(fā)育離不開的最根本生物現(xiàn)象，通過凋亡可以平衡機(jī)體內(nèi)細(xì)胞的數(shù)目，去除衰老、過剩、有害的細(xì)胞。

編輯ppt與細(xì)胞凋亡有關(guān)的疾病

編輯ppt細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征凋亡的起始：微絨毛消失，細(xì)胞間接觸消失，與周圍細(xì)胞脫離，細(xì)胞質(zhì)中線粒體大體完整，染色質(zhì)固縮；細(xì)胞質(zhì)密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細(xì)胞色素C到胞漿，膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸外翻到膜外表；凋亡小體的形成。核膜核仁破碎，核染色質(zhì)斷裂為大小不等的片段，與某些細(xì)胞器如線粒體一起聚集，為反折的細(xì)胞膜所包圍；凋亡小體逐漸被周圍專職或非專職吞噬細(xì)胞吞噬。

編輯ppt編輯ppt是細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷或大劑量細(xì)胞毒藥物作用后出現(xiàn)的反響。早期表現(xiàn)為細(xì)胞膜破壞，線粒體腫脹。繼而溶酶體破裂,細(xì)胞內(nèi)容物流出,引起炎癥。1.2細(xì)胞壞死編輯ppt細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的區(qū)別——————————————————————————————————————壞死凋亡1.性質(zhì)2.誘導(dǎo)因素強(qiáng)烈刺激，隨機(jī)發(fā)生較弱刺激，非隨機(jī)發(fā)生3.生化特點(diǎn)4.形態(tài)變化6.DNA電泳5.炎癥反響7.凋亡小體8.基因調(diào)控被動過程，無新蛋白合成，不耗能主動過程，有新蛋白合成，耗能細(xì)胞結(jié)構(gòu)全面溶解、破壞、細(xì)胞腫脹胞膜及細(xì)胞器相對完整細(xì)胞皺縮，核固縮彌散性降解，電泳呈均一DNA片狀DNA片段化〔180-200bp〕，電泳呈“梯〞狀條帶溶酶體破裂，局部炎癥反響溶酶體相對完整，局部無炎癥反響有病理性，非特異性生理性或病理性，特異性無有無編輯ppt2細(xì)胞凋亡的流式檢測方法利用流式儀測定細(xì)胞光散射可對凋亡細(xì)胞進(jìn)行分析凋亡早期細(xì)胞因體積減小，胞漿及染色質(zhì)固縮，F(xiàn)SC變小，SSC增大凋亡晚期細(xì)胞FSC、SSC均變小壞死細(xì)胞那么因細(xì)胞膜通透性改變，細(xì)胞腫脹，F(xiàn)SC、SSC變大，胞膜破裂，胞內(nèi)含物釋出后FSC、SSC均變小。編輯ppt

2.1PI單染檢測2.2AnnexinV/PI(7-AAD)雙染檢測2.3細(xì)胞內(nèi)鈣離子測定2.4線粒體膜電位檢測2.5Caspases細(xì)胞酶的檢測2.6DNA碎片分析：Apo-BrdU2.7凋亡相關(guān)蛋白：Fas、Bcl-2、P532細(xì)胞凋亡的流式檢測方法編輯ppt與細(xì)胞周期相同，利用PI染色，通過檢測DNA含量來同時(shí)判定細(xì)胞周期和凋亡。凋亡過程中，細(xì)胞內(nèi)核酸酶釋放，細(xì)胞DNA發(fā)生有序降解，被降解的低分子量DNA片段從變性細(xì)胞膜〔經(jīng)乙醇及透膜劑處理〕漏出細(xì)胞外，使得凋亡細(xì)胞內(nèi)的DNA含量減低，在流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞DNA含量直方圖中G0/G1峰前可出現(xiàn)亞二倍體峰，即凋亡峰通過峰下的面積值可得出凋亡細(xì)胞在所測細(xì)胞群中所占的比率。2.1PI單染檢測編輯ppt編輯pptPI單染色法的最大優(yōu)點(diǎn)在于獲得凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的同時(shí)可以與細(xì)胞周期中其他時(shí)相的細(xì)胞進(jìn)行比較該法簡便、標(biāo)本制備容易、檢測費(fèi)用低缺點(diǎn)：PI單染色法無法確認(rèn)來自哪一時(shí)相的凋亡，對于S期和G2/M期的細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，凋亡峰有時(shí)與G1峰或S峰相互重疊，導(dǎo)致G1峰或S峰增寬而無典型的sub-G1峰出現(xiàn)，所以無法分析來自S期或G2/M期細(xì)胞的凋亡，應(yīng)借助其他方法進(jìn)行檢測編輯ppt磷脂酰絲氨酸〔phosphatidylserine,PS〕異位：正常情況下，PS位于細(xì)胞膜內(nèi)層，細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)PS從細(xì)胞膜內(nèi)翻轉(zhuǎn)并暴露在細(xì)胞膜外層，是細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期事件。

2.2AnnexinV/PI(7-AAD)雙染檢測編輯pptAnnexinV選擇性結(jié)合PS。用帶有熒光標(biāo)記的AnnexinV，就可以用流式細(xì)胞儀非常簡單而直接地檢測到磷酯酰絲氨酸的外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特征。PI(7-AAD)可以染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞，呈現(xiàn)紅色熒光。對于壞死細(xì)胞，由于細(xì)胞膜的完整性已經(jīng)喪失，AnnexinV可以進(jìn)入到細(xì)胞漿內(nèi)，與位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷酯酰絲氨酸結(jié)合，從而也使壞死細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。

編輯ppt此法簡單、可靠，由于凋亡時(shí)細(xì)胞膜的改變大大早于DNA的改變，因此AnnexinV/PI(或7-AAD)雙染色是檢測早期凋亡細(xì)胞的敏感方法。由于該法必須用活細(xì)胞，因此檢測時(shí)間受到限制，且對凋亡晚期細(xì)胞和壞死細(xì)胞無法準(zhǔn)確區(qū)分。編輯pptFluo-3-Am為新型的高度特異性Ca2+熒光指示劑，進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)非特異性酯酶脫去Am酯，成為脂溶Fluo-3留在細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)Fluo-3與胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后，其熒光強(qiáng)度是Fluo-3本身的40倍以上，當(dāng)用480nm波長激發(fā)時(shí)，其熒光強(qiáng)度與游離鈣離子濃度成正比。Fluo-4將Fluo-3結(jié)構(gòu)中的Cl替換成F，熒光強(qiáng)度比Fluo-3強(qiáng)1倍Fluo-4與鈣離子的親和力和Fluo-3近似，使用上和Fluo-3也根本相同，可以使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。Fluo-4-AM是Fluo-4的乙酰甲酯衍生物，通過培養(yǎng)，能夠輕易進(jìn)入細(xì)胞中。AM進(jìn)入細(xì)胞后會被胞內(nèi)酯酶所水解，產(chǎn)生的Fluo-4隨后會和鈣離子結(jié)合并發(fā)出熒光。2.3細(xì)胞內(nèi)鈣離子測定編輯ppt編輯pptJC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位(mitochondrialmembranepotential)ΔΨm的理想熒光探針。線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以產(chǎn)生紅色熒光……正常細(xì)胞

線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體(monomer)，可以產(chǎn)生綠色熒光……凋亡細(xì)胞

線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測到細(xì)胞膜電位的下降，同時(shí)也可以用JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)檢測指標(biāo)。2.4線粒體膜電位檢測編輯ppt喜樹堿(CPT)誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，3小時(shí)后用JC-1檢測線粒體膜電位的改變。可見，凋亡細(xì)胞紅色熒光降低。編輯pptcaspases家族在凋亡過程中起到非常重要的作用，其中caspases-3是最重要的指示蛋白酶。研究結(jié)果說明，caspases-3可在凋亡發(fā)生的早期被激活，激活的caspases-3繼而使其他caspases裂解并被激活，同時(shí)還可激活細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的相關(guān)成分。caspases-3的活性只有在凋亡的早期才能檢測到，隨后在凋亡的過程中持續(xù)升高，在凋亡的晚期快速下降。對caspases-3的連續(xù)監(jiān)測，可動態(tài)觀察凋亡的整個(gè)過程。2.5Caspases細(xì)胞酶的檢測編輯ppt該法簡單、快速，但不適于常規(guī)多功能流式細(xì)胞儀(不具備紫外光源)的檢測。主要有Caspases-3流式細(xì)胞檢測試劑盒，Caspases-2/Caspases-4/Caspases-6/Caspases-7/Caspases-9等抗體編輯ppt2.6DNA碎片分析：Apo-BrdU核酸內(nèi)切酶活化使核小體內(nèi)DNA斷裂為50~300kb片段，裂解為200bpDNA碎片，暴露出多個(gè)3’羥基末端。利用外源性TdT使外源性dUTP或

BrdUTP連接到DNA碎片的3'羥基末端。以熒光標(biāo)記抗dUTP或抗BrdUTP抗體檢測dUTP或BrdUTP數(shù)量，從而間

接檢測凋亡加PI染色，在定量檢測凋亡細(xì)胞同時(shí)顯示凋亡細(xì)胞在細(xì)胞周期中所位置編輯ppt在此法中，細(xì)胞固定先用甲醛，再用乙醇因?yàn)樵诘蛲黾?xì)胞中可以檢測出兩群DNA：一群是低分子量的DNA(100~200bp)，彌散分布在凋亡細(xì)胞

另一群是高分子量的DNA或仍然黏附在核基質(zhì)上的DNA，

乙醇固定后沖洗不能將其從細(xì)胞中洗去。編輯ppt用樹堿(CPT)誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，0、120和150分鐘時(shí)用TUNEL(BrdUTP)/PI雙染法檢測DNA斷裂，同時(shí)分析細(xì)胞周期?？梢姷蛲鲭S著誘導(dǎo)時(shí)間的增加而增多，且可知凋亡發(fā)生的時(shí)相。編輯ppt此方法靈敏度高、特異性好，目前己被廣泛采用。由于DNA斷裂發(fā)生在細(xì)胞凋亡的早期階段，先于其形態(tài)學(xué)上的改變，可用于早期凋亡的研究。通過與PI雙染色，克服了PI單染色法的缺點(diǎn)，可以鑒定細(xì)胞凋亡發(fā)生在細(xì)胞周期的具體時(shí)相。編輯ppt2.7凋亡相關(guān)蛋白：Fas、Bcl-2、P53的檢測在細(xì)胞凋亡的研究中，要重視對凋亡相關(guān)蛋白的檢測，它們在特定的信號傳導(dǎo)通路中與啟動凋亡的信號分子相互作用。從凋亡的開始到凋亡的結(jié)束，許多信號傳導(dǎo)通路都需要或受到特定的蛋白間相互作用的調(diào)控。凋亡相關(guān)蛋白：主要有Apo-1(Fas)、FasL的相關(guān)抗體，Bcl-2相關(guān)檢測抗體、p53等調(diào)控凋亡的基因蛋白產(chǎn)物編輯ppt本卷須知有些蛋白存在于細(xì)胞膜外表，如Fas；有些那么存在于胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)，如p53、bc1-2標(biāo)本的處理方法不同破膜是關(guān)鍵，最正確的破膜既能使膜通透性增強(qiáng)，又能保持膜的完整性，使膜外表的抗原分子不被破壞。皂角素(saponin)是目前最正確的破膜劑，它優(yōu)于乙醇、甲醇和甲醛等。編輯ppt3.細(xì)胞凋亡檢測面臨的問題3.1凋亡假陽性產(chǎn)生原因：PS外翻使凋亡細(xì)胞和凋亡小體容易被鄰近細(xì)胞所吸附并被吞噬吞噬細(xì)胞并非僅為專職的吞噬細(xì)胞(如單核和粒細(xì)胞)，成纖維細(xì)胞或上皮細(xì)胞也具吞噬作用。尤其是實(shí)體瘤，?？梢娫诘蛲黾?xì)胞周圍的腫瘤和非腫瘤細(xì)胞中有含有凋亡小體的吞噬體。鄰近細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞后的殘留物中即包含了變化的細(xì)胞膜、斷裂DNA等凋亡特征物。即使很輕微處理〔胰酶消化/機(jī)械振蕩/細(xì)胞刮取等〕均會造成PS的外翻。編輯ppt3.2區(qū)分凋亡、壞死和凋亡的“壞死期〞：產(chǎn)生原因：晚期凋亡與壞死相似細(xì)胞膜破裂，用PI排染和AnnexinV結(jié)合實(shí)驗(yàn)無法區(qū)分。胰酶消化時(shí)間過長、機(jī)械損傷(如細(xì)胞刮取、腫瘤細(xì)胞分離或反復(fù)離心等)、電穿孔或某些藥物處理時(shí)，細(xì)胞膜的通透性和對稱性均會改變。解決方法：形態(tài)學(xué)特征是區(qū)分凋亡和壞死的“金標(biāo)準(zhǔn)〞。編輯ppt3.3樣本制備過程中凋亡細(xì)胞的選擇性喪失：貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的別離凋亡早期，細(xì)胞即脫離培養(yǎng)瓶外表并懸浮在培養(yǎng)液中。因此去除培養(yǎng)液，然后加胰酶或EDTA消化的方法不可防止的會失去很多凋亡細(xì)胞。---將培養(yǎng)液和消化下來的細(xì)胞合在一起胰酶消化本身就傾向于破壞細(xì)胞膜已破損的晚期凋亡和壞死細(xì)胞，導(dǎo)致喪失。密度梯度離心密度梯度離心選擇性喪失即將死亡和死亡細(xì)胞，因凋亡早期