現(xiàn)代微生物技術(shù)檢測技術(shù)省名師優(yōu)質(zhì)課獲獎(jiǎng)?wù)n件市賽課一等獎(jiǎng)?wù)n件

當(dāng)代微生物檢測技術(shù)09級(jí)基地二班馮俊霞鄒梓姣李梅香

龍文英劉芬芳楊成志第1頁主要內(nèi)容認(rèn)識(shí)微生物微生物污染

慣用微生物檢測技術(shù)新型微生物檢測技術(shù)微生物檢測應(yīng)用及實(shí)例

第2頁認(rèn)識(shí)微生物微生物：形體微小，結(jié)構(gòu)簡單低等生物統(tǒng)稱。包含病毒、細(xì)菌、放線菌、真菌···特點(diǎn)：

種類多分布廣繁殖快適應(yīng)性強(qiáng)易變異藥品食品環(huán)境······第3頁第4頁食品據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)計(jì)，全世界每年有數(shù)以億計(jì)食源性疾病患者中，70%是因?yàn)楦鞣N致病性微生物污染造成。我國每年發(fā)生細(xì)菌性食物中毒事件占食物中毒事件總數(shù)30%～90%，中毒人數(shù)占食物中毒總?cè)藬?shù)60%～90%。第5頁藥品據(jù)報(bào)道,1970年7月至1971年3月,美國25家醫(yī)院因?yàn)檩斪⒘思?xì)菌污染葡萄糖致使378個(gè)患者得敗血癥,40人死亡。我國也在1991至1993年因人血白蛋白污染,輸注發(fā)生了46例感染事件,死亡8例。第6頁環(huán)境肺結(jié)核、百日咳、流行性感冒等疾病傳輸空氣污染沙門氏桿菌病霍亂胃腸道疾病水體污染其它污染土壤化裝品航空燃料······第7頁怎樣及時(shí)、有效檢出微生物？第8頁慣用微生物檢測技術(shù)1.常規(guī)檢測方法平板分離、鏡檢、生化試驗(yàn)等

2.免疫學(xué)方法

免疫熒光標(biāo)識(shí)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)自動(dòng)酶標(biāo)免疫檢測儀3.分子生物學(xué)方法

核酸探針

PCR技術(shù)

基因芯片技術(shù)4.聯(lián)合檢測方法:PCR-ELISA、IMS-PCR等。

5.物理學(xué)方法電阻抗技術(shù)、微熱量計(jì)技術(shù)、放射測量技術(shù)

生物傳感器

第9頁樣品采集樣品處理（分離、篩選）檢驗(yàn)結(jié)果匯報(bào)常規(guī)微生物檢測流程第10頁酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA）底物顯色定性或定量分析原理:包被反應(yīng)加入待測抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體洗滌使結(jié)合在固相上抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合分離1234缺點(diǎn)：

該技術(shù)操作技巧性較強(qiáng)交叉反應(yīng)比較嚴(yán)重、假陽性多該法檢測限較高優(yōu)點(diǎn)：

靈敏、特異、快速、穩(wěn)定以及易于自動(dòng)化操作第11頁P(yáng)CR技術(shù)PCR技術(shù)在微生物檢測上原理：

利用某一特定微生物特有基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。若有條帶，則說明待測樣品中含有目標(biāo)菌，且目標(biāo)菌含量與條帶亮度呈正相關(guān)；若無條帶，則說明待測樣品中無目標(biāo)菌。第12頁缺點(diǎn)：

食品中一些物質(zhì)會(huì)干擾Taq聚合酶作用。

只能檢測微生物存在，微生物產(chǎn)生毒素則不能檢測出來假陽性或假陰性結(jié)果出現(xiàn)。優(yōu)點(diǎn)：

特異性強(qiáng)靈敏度高速度快簡便、高效PCR技術(shù)以其本身這些優(yōu)勢作為食源性致病微生物檢測關(guān)健技術(shù)在食品中得到廣泛應(yīng)用第13頁準(zhǔn)確、高靈敏度

自動(dòng)化檢測快速檢測操作簡單改進(jìn)質(zhì)量難控

費(fèi)時(shí)費(fèi)勁易發(fā)生主觀片面錯(cuò)誤過程繁瑣傳統(tǒng)方法新型方法第14頁新型微生物檢測技術(shù)膠體金免疫層析檢測條技術(shù)微生物實(shí)時(shí)熒光光電檢測技術(shù)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（不講）

ATP熒光法快速檢測技術(shù)第15頁膠體金免疫層析檢測條技術(shù)襯板樣品墊金標(biāo)墊吸收墊NC膜膠體金是氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，聚合成一定大小金顆粒，因?yàn)殪o電相斥作用而成為穩(wěn)定膠體狀態(tài)，膠體金顆粒對(duì)蛋白有很強(qiáng)吸附作用。以乙肝病毒檢測為例固定特異性抗體（乙肝表面抗體）乙肝表面抗原與膠體金結(jié)合膠體金標(biāo)識(shí)復(fù)合物第16頁常見膠體金免疫層析檢測條大腸桿菌O157李斯特氏菌沙門氏菌特點(diǎn)：定性檢測死菌和活菌、病毒，相對(duì)ELISA來說結(jié)果直觀、準(zhǔn)確、快速，且無需專門檢測儀器。該法被認(rèn)為是微生物和傳染病診療技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化最有前途新技術(shù)之一。第17頁原理：依據(jù)螢火蟲發(fā)光原理，在有氧條件下，蟲光素酶催化D-熒光素和ATP之間發(fā)生氧化反應(yīng)，形成氧化熒光素并發(fā)出熒光，其生化反應(yīng)式以下：ATP＋D-熒光素＋O2————>AMP＋氧化熒光素＋PPi＋CO2＋熒光Mg2+蟲光素酶ATP熒光法快速檢測蟲光素酶D—熒光素ATP數(shù)量↑在均過量情況下：熒光強(qiáng)度↑測量相對(duì)熒光值微生物總數(shù)量那么第18頁常見熒光檢測儀ATP熒光法檢測微生物特點(diǎn)：可實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)、穩(wěn)定、快速檢測微生物總數(shù)需求，但設(shè)備比較昂貴，對(duì)儀器清洗保養(yǎng)要求尤其高。檢測時(shí)需做預(yù)處理，去除胞外游離ATP。保溫2天，檢測30分鐘單個(gè)樣品檢測（5min)96個(gè)樣品檢測第19頁檢測儀器可同時(shí)放32個(gè)檢測管、同溫檢測一次性檢測管基于Windows系統(tǒng)分析軟件一臺(tái)計(jì)算機(jī)可控制32臺(tái)檢測儀、軟件自動(dòng)將儀器中搜集到數(shù)據(jù)換算成CFU濃度，對(duì)不合格樣本提出預(yù)警計(jì)算機(jī)以不一樣形式匯報(bào)進(jìn)行自動(dòng)存檔和處理Biolumix微生物實(shí)時(shí)熒光光電檢測系統(tǒng)第20頁一次性檢測管黃色和藍(lán)色兩種LED燈檢測區(qū)熒光管過濾膜孵育區(qū)CO2傳感器兩個(gè)基本技術(shù)：

1.膜技術(shù)2.CO2傳感器可將樣本和微生物所在孵育區(qū)與檢測區(qū)分開，保持檢測區(qū)清澈，同時(shí)檢測到顏色和熒光改變，含有主要防干擾能力。經(jīng)過在一次性檢測管底部嵌入一個(gè)透明CO2固體傳感器來檢測微生物生長過程中所釋放CO2。當(dāng)有CO2進(jìn)入時(shí)傳感器會(huì)變色。只有氣體能夠穿透這個(gè)傳感器，而液體、微生物和固體顆粒不能經(jīng)過，從而防止了其它原因干擾。第21頁微生物檢測技術(shù)應(yīng)用及其實(shí)例醫(yī)學(xué)檢測

食品檢測

環(huán)境檢測

Clicktoaddtitleinhere4123主要用于：第22頁一、醫(yī)學(xué)檢測體外培養(yǎng)判定藥敏試驗(yàn)合理用藥提倡聯(lián)合用藥,反對(duì)亂、濫用抗生素,警覺人群中耐藥菌株增加體外培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)第23頁常見微生物感染疾病：

已有固定檢驗(yàn)方法不確診微生物感染疾病：

傳統(tǒng)經(jīng)典方法和當(dāng)代微生物技術(shù)進(jìn)行判定

判定第24頁擴(kuò)散法稀釋法E試驗(yàn)聯(lián)合藥品敏感試驗(yàn)青霉素類頭孢菌素類β-內(nèi)酰胺類/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑糖肽類······選擇藥敏試驗(yàn)抗菌藥品藥敏試驗(yàn)擴(kuò)散法原理：將含有定量抗菌藥品紙片貼在測試菌瓊脂平板上，紙片中所含藥品吸收瓊脂中水分溶解后不停地向紙片周圍擴(kuò)散，形成遞減濃度梯度。在紙片周圍可抑菌濃度范圍內(nèi)測定菌生長被抑制，從而形成無菌生長透明圈即抑菌圈。抑菌圈大小反應(yīng)測試菌對(duì)測定藥品敏感性。藥敏結(jié)果（抑菌圈直徑、MIC值和IC值等）參照NCCLS標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果：敏感：表示測試菌可被測定藥品常規(guī)劑量給藥后所到達(dá)血藥濃度所抑制或殺滅。中介：指測試菌對(duì)常規(guī)劑量用藥后體液或組織中藥品濃度反應(yīng)性低于敏感株，但在測定藥品濃集部位體液（如尿液）或使用高于正常給藥量（如β-內(nèi)酰胺類）臨床上使用有效。耐藥：指測試菌不能被在體內(nèi)感染部位能到達(dá)抗菌藥品濃度所抑制。第25頁第26頁超級(jí)細(xì)菌超級(jí)細(xì)菌年首先發(fā)覺于印度新德里,該細(xì)菌攜帶NDM-1基因，幾乎對(duì)全部抗生素含有抗性。所以,超級(jí)細(xì)菌出現(xiàn)為人類抗生素濫用敲響了警鐘。當(dāng)前檢測超級(jí)細(xì)菌主要用基于PCR基礎(chǔ)檢測方法超級(jí)細(xì)菌NDM-1基因。如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法能夠在恒溫下1h內(nèi)將核酸擴(kuò)增到109拷貝,含有操作簡單、快速、

特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。第27頁二：食品檢測常規(guī)微生物項(xiàng)目：細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群、大腸桿菌、酵母總數(shù)、霉菌總數(shù)致病微生物項(xiàng)目：沙門氏菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157：H7、彎曲桿菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌、假單胞菌等第28頁

1.常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)檢測方法（以沙門氏菌為例）食品樣品在含有營養(yǎng)非選擇性培養(yǎng)基中增菌，使受損傷沙門氏菌細(xì)胞恢復(fù)到穩(wěn)定生理狀態(tài)。加工食品均應(yīng)經(jīng)過前增菌選擇性增菌選擇性平板分離生物化學(xué)篩選血清學(xué)技術(shù)判定前增菌此培養(yǎng)基允許沙門氏菌連續(xù)增菌，同時(shí)阻止大多數(shù)其它細(xì)菌增殖。未經(jīng)加工食品無須經(jīng)過前增菌而直接增菌。采取固體選擇培養(yǎng)基，抑制非沙門氏菌生長，提供肉眼可見疑似沙門氏菌純菌落識(shí)別。排除大多數(shù)非沙門氏菌，也提供了沙門氏菌培養(yǎng)物菌屬初步判定。本菌屬種類繁多，抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，現(xiàn)已發(fā)覺多個(gè)血清型，我國已發(fā)覺血清型近200個(gè)。第29頁中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)GB4789.4-凍肉、蛋品、乳品及其它加工食品鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其它未經(jīng)加工食品前增菌法25g＋BPW225mL36℃±1℃普通4h，干蛋品18h～24h10mL＋MM（或TTB）100mL10mL＋SC100mL直接增菌法25g＋滅菌生理鹽水25mL檢樣勻液25mL＋MM（或TTB）100mL檢樣勻液25mL

＋SC100mLBSDHL（或HE、WS、SS）TSI（排除A/AH2S－結(jié)果），靛基質(zhì)，尿素，KCN，賴氨酸H2S＋靛－尿－KCN－賴＋（或一項(xiàng)不符）沙門氏菌血清學(xué)試驗(yàn)甘露醇+山梨醇+H2S＋靛＋尿－KCN－賴＋H2S－靛－尿－KCN－賴＋/－非如左述各種反應(yīng)結(jié)果沙門氏菌血清學(xué)試驗(yàn)

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