藥物的體外抗菌試驗(yàn)藥物制劑的微生物學(xué)檢查課件

微生物在藥學(xué)中的應(yīng)用

抗生素其它藥物微生物與藥物變質(zhì)（自學(xué)）藥物的體外抗菌試驗(yàn)藥物制劑的微生物學(xué)檢查微生物在藥學(xué)中的應(yīng)用抗生素1抗生素（antibiotics）原始含義：由微生物產(chǎn)生的、能抑制其它微生物生長的物質(zhì)?，F(xiàn)指：生物（包括微生物、植物和動(dòng)物）在其生命活動(dòng)過程中產(chǎn)生的（或由其它方法獲得的）、能在低微濃度下有選擇性地抑制或影響它種生物機(jī)能的有機(jī)物質(zhì)。抗生素（antibiotics）原始含義：由微生物產(chǎn)生的、能2

醫(yī)療用抗生素的特點(diǎn)差異毒力大生物活性強(qiáng)、有不同抗菌譜不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性毒副作用小，不易引起超敏反應(yīng)半衰期長，生物利用度高醫(yī)療用抗生素的特點(diǎn)差異毒力大3抗生素的分類抗生素產(chǎn)生菌的分離和篩選抗生素的制備抗生素的生物合成抗生素的主要作用機(jī)制

抗藥性抗生素的單位及效價(jià)測定抗生素的分類4

（1）按化學(xué)結(jié)構(gòu)分類?-內(nèi)酰胺類—青霉素、頭孢菌素等

四環(huán)類—四環(huán)素、土霉素、金霉素

氨基糖苷類—鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素

大環(huán)內(nèi)酯類—紅霉素、螺旋霉素、麥迪霉素

多肽類—多黏菌素、桿菌肽等多烯類—制霉菌素、兩性霉素B、萬古霉素 苯羥基胺類—氯霉素 蒽環(huán)類—柔紅霉素、阿霉素 環(huán)橋類—利福霉素 其他

（1）按化學(xué)結(jié)構(gòu)分類?-內(nèi)酰胺類—青霉素、頭孢菌素等5（2）按作用對象抗G+—青霉素等抗G-—鏈霉素等廣譜—四環(huán)素、紅霉素、卡那霉素、頭孢菌素等?？拐婢獌尚悦顾谺、制霉菌素、灰黃霉素等?？鼓[瘤—阿霉素、絲裂霉素、柔紅霉素等。（2）按作用對象抗G+—青霉素等6

新抗生素產(chǎn)生菌的分離和篩選

（以放線菌為例）從土壤中分離放線菌（初篩）：采樣→稀釋分離（涂平板）→獲得單菌落→搖瓶→濾紙片抗菌試驗(yàn)篩選新抗生素產(chǎn)生菌的分離和篩選

（以放線菌為例）7抗生素生產(chǎn)的工藝過程菌種→孢子制備→種子制備→發(fā)酵

→發(fā)酵液預(yù)處理→提取及精制→成品檢驗(yàn)→成品包裝抗生素生產(chǎn)的工藝過程菌種→孢子制備→種子制備8抗藥性（drugresistance）p287定義—在微生物或腫瘤細(xì)胞多次與藥物接觸發(fā)生敏感性降低的現(xiàn)象，是微生物對藥物所具有的相對抗性。獲得抗藥性多重抗藥性交叉抗藥性賴藥性耐受性抗藥性（drugresistance）p287定義—在微9抗菌藥物的發(fā)展史也就是細(xì)菌對其耐藥性的發(fā)展史（1）抗菌藥物只要使用了足夠時(shí)間，就會(huì)出現(xiàn)細(xì)菌耐藥性，如使用青霉素25年后出現(xiàn)耐青霉素肺炎球菌、氟喹諾酮使用10年后出現(xiàn)了腸桿菌耐藥；（2）耐藥性是不斷進(jìn)化的，隨著抗菌藥物的應(yīng)用，耐藥也從低度耐藥向中度、高度耐藥轉(zhuǎn)化；（3）對一種抗菌藥物耐藥的微生物可能對其他抗菌藥物也耐藥；（4）細(xì)菌耐藥性的消亡很慢；（5）使用抗菌藥物治療后，患者容易攜帶耐藥菌。抗菌藥物的發(fā)展史也就是細(xì)菌對其耐藥性的發(fā)展史（1）抗菌藥物只10一、抗藥性產(chǎn)生的遺傳機(jī)制1、自發(fā)突變與藥物選擇（1）由敏感菌的遺傳物質(zhì)自發(fā)突變產(chǎn)生。（2）藥物選擇的結(jié)果是殺死敏感菌，耐藥菌富集。2、細(xì)胞間抗藥性的基因轉(zhuǎn)移 染色體上的耐藥基因—通過接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)座子而轉(zhuǎn)移。 質(zhì)粒上的耐藥基因—自行復(fù)制，代代相傳，并在不同種屬間轉(zhuǎn)移（性菌毛的接合作用）一、抗藥性產(chǎn)生的遺傳機(jī)制11二、抗藥性產(chǎn)生的生物化學(xué)機(jī)制（1）產(chǎn)生鈍化酶；（2）抗菌藥物作用靶位的改變；（3）細(xì)胞膜通透性的改變，使抗菌藥物不能進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞或被細(xì)菌細(xì)胞膜的藥物泵排出細(xì)胞；（4）形成細(xì)胞外膜，為細(xì)菌躲避抗菌藥物作用提供場所二、抗藥性產(chǎn)生的生物化學(xué)機(jī)制（1）產(chǎn)生鈍化酶；12β-內(nèi)酰胺酶抗生素耐藥菌產(chǎn)生耐藥的β-內(nèi)酰胺酶。（鈍化酶）β-內(nèi)酰胺類抗生素的原始靶位為PBPs（penicillin-bindingprotein），耐藥菌的PBPs的數(shù)目、位置、與抗生素親和力發(fā)生改變，青霉素失活。（靶位的改變）磺胺類耐藥菌株合成了對磺胺不敏感的二氫葉酸合成酶，而引起耐藥。（靶位的改變）喹諾酮類耐藥菌的gyrA(gyrase)基因突變，DNA螺旋酶A亞單位的變化，對該類藥物不敏感。其中，gyrase（DNA旋轉(zhuǎn)酶）為一種類型的拓?fù)洚悩?gòu)酶，引入負(fù)超螺旋至閉環(huán)雙鏈DNA中。（靶位的改變）β-內(nèi)酰胺酶抗生素耐藥菌產(chǎn)生耐藥的β-內(nèi)酰胺酶。（鈍化酶）13綠膿桿菌對β-內(nèi)酰胺類耐藥，細(xì)菌外膜限制抗生素分子滲入膜內(nèi)。四環(huán)素耐藥菌由耐藥決定簇編碼的膜定位蛋白介導(dǎo)使四環(huán)素從細(xì)菌細(xì)胞流出而耐菌。（細(xì)胞膜通透性的改變）綠膿桿菌對β-內(nèi)酰胺類耐藥，細(xì)菌外膜限制抗生素分子滲入膜內(nèi)。14三、耐藥性的控制1、避免耐藥菌傳播（醫(yī)院）2、合理用藥（1）抗生素可不用盡量不用，使用時(shí)應(yīng)足量。（2）合理聯(lián)合用藥3、抗耐藥菌新抗生素的尋找，如酶抑制劑抗生素等。4、耐藥機(jī)制的研究—耐藥規(guī)律尋找，有助于合理用藥。

三、耐藥性的控制1、避免耐藥菌傳播（醫(yī)院）15四、耐藥性和青霉素酶的測定1、耐藥性—藥敏試驗(yàn)2、青霉素酶耐藥菌接平板培養(yǎng)→加含青霉素的淀粉→加I2出現(xiàn)透明圈（eg.金葡菌產(chǎn)酶株）。四、耐藥性和青霉素酶的測定16MIC和MBC的測定殺菌曲線

最低抑菌濃度（minimal

inhibitoryconcentration,MIC）最低殺菌濃度(minimalbactericidalconcentration,MBC)

第二十章藥物的體外抗菌試驗(yàn)MIC和MBC的測定第二十章藥物的體外抗菌試驗(yàn)17試管連續(xù)稀釋法適用于試驗(yàn)菌數(shù)量較少的場合，試驗(yàn)工作量大。平板倍比稀釋法目前抗生素的臨床前研究一般采用此法。平板倍比稀釋法是根據(jù)藥物在瓊脂培養(yǎng)基中擴(kuò)散的原理，將細(xì)菌接種在含有不同濃度抗生素的平板上恒溫培養(yǎng)16~18小時(shí)，可抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為最低抑菌濃度（MIC），可殺滅細(xì)菌的最低藥物濃度為最低殺菌濃度（MBC）。MIC或MBC值愈小，則藥物的抑菌或殺菌作用愈強(qiáng)。最低殺菌濃度(MBC)測定

將系列稀釋的抗菌藥物溶液與試驗(yàn)菌液(終濃度為105-106CFU/ml)混合，對照管不含抗菌藥物，經(jīng)37℃，18～20h孵育后，將無細(xì)菌生長的各管培養(yǎng)液轉(zhuǎn)種于不含抗菌藥物的瓊脂平皿表面，37℃再孵育18h，細(xì)菌減少99.9%的最低藥物濃度。試管連續(xù)稀釋法18藥物的體外抗菌試驗(yàn)藥物制劑的微生物學(xué)檢查課件19將菌懸液與一定濃度的藥物混合，使其濃度為105CFU/ml左右，于37℃恒溫培養(yǎng)，定時(shí)取樣進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)。以細(xì)菌濃度對數(shù)為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制殺菌曲線。實(shí)驗(yàn)應(yīng)包括空白對照和陽性對照。藥物的殺菌效果越好，細(xì)菌濃度隨培養(yǎng)時(shí)間下降的越快，藥效越好。乳酸左氧氟沙星對大腸埃希氏菌763(2MBC=0.125mg/ml)的殺菌曲線

1：對照；2：乳酸左氧氟沙星對大腸埃希氏菌為24h殺死全部細(xì)菌。

將菌懸液與一定濃度的藥物混合，使其濃度為120一、抗生素的效價(jià)單位效價(jià)（potency）：在同一條件下比較抗生素檢品和標(biāo)準(zhǔn)品的抗菌活性，從而得出檢品的效價(jià)。檢品的抗菌活性標(biāo)準(zhǔn)品的抗菌活性單位（unit,u）是衡量抗生素有效成分的具體尺度。效價(jià)＝×100％一、抗生素的效價(jià)單位效價(jià)＝×100％21各種單位：1重量單位

以抗生素活性部分的重量為單位，1mg=1000U2類似重量單位

以抗生素鹽類純品的重量為單位，1mg=1000U3重量折算單位以原始的生物活性單位相當(dāng)?shù)膶?shí)際重量為1單位加以折算，如青霉素G鈉鹽：1mg=1667u（以50ml肉湯中抑制金葡菌生長的最小青霉素量為1U）4標(biāo)準(zhǔn)品—與商品同質(zhì)的、純度較高的抗生素，每毫克含有一定量的單位，可供作測定效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)。我國由中國藥品生物制品檢定所分發(fā)5標(biāo)示量—抗生素制劑標(biāo)簽上的標(biāo)量（單位或重量）各種單位：22物理方法化學(xué)方法微生物學(xué)方法稀釋法比濁法瓊脂擴(kuò)散法

管碟法——二劑量法（常用）抗生素的效價(jià)測定—管碟法物理方法抗生素的效價(jià)測定—管碟法23抗生素的效價(jià)測定—管碟法原理：抗生素在瓊脂平板培養(yǎng)基中的擴(kuò)散滲透作用抗生素在一定濃度范圍內(nèi)，其濃度和抑菌圈直徑成曲線關(guān)系抗生素的效價(jià)測定—管碟法原理：24SHSLUHULθ=D·antilog（IV/W)W=(SH+UH)-(SL+UL)V=(UH+UL)-(SH+SL)I=lg高劑量/低劑量=lg2（一般）D=高劑量（標(biāo)準(zhǔn)品）/高劑量（檢品）＝1（一般）SHSLUHULθ=D·antilog（IV/W)25氨基酸維生素甾體化合物酶與酶抑制劑菌體制劑與活菌制劑（微生態(tài)制劑）核酸類藥物免疫調(diào)節(jié)劑受體拮抗劑微生物多糖微生物免疫制劑微生物毒素其他氨基酸26酶抑制劑

（非感染性的生理疾病與人體某些酶的失控有關(guān)。）卡普托利是血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制劑：降血壓Prosca是5α-睪丸酮還原酶抑制劑：治療前列腺肥大烏苯美司是氨肽酶（細(xì)胞表面的一種水解酶）抑制劑：刺激細(xì)胞免疫作用，用作腫瘤輔助治療。洛伐他汀即1，3-羥基戊二酰輔酶A（HMGCoA）是還原酶抑制劑：治療高血壓普伐他?。航笛幇⒖úㄌ鞘铅?葡萄糖苷酶抑制劑：治療糖尿病、肥胖與餐后高血糖伏格列波糖是α-葡萄糖苷酶抑制劑，用于治療糖尿病。酶抑制劑27通過分離參與各種病的酶，是能否找到有效的酶抑制劑最重要的步驟。有了自己獨(dú)特的篩選模型，就能創(chuàng)造新藥。從蛋白激酶-C抑制劑中分離到了有抗腫瘤活性的物質(zhì)，從HIV蛋白酶抑制劑中找到了有可能治艾滋病的藥物。通過分離參與各種病的酶，是能否找到有效的酶抑制劑最重要的步驟28膽固醇是高血壓的重要原因，膽固醇生成的一個(gè)限速性步驟是1，3-羥基戊二酰輔酶A（HMGCoA）經(jīng)過HMG-CoA還原酶的作用，經(jīng)3-甲-3，5-二羥戊酸至鯊烯，最后生成膽固醇。若這個(gè)限速性還原反應(yīng)被抑止，就可以抑制膽固醇的生成。 根據(jù)這種機(jī)理，Merck公司從土曲菌中找到HMG-CoA還原酶抑制劑，并把它開發(fā)成為洛伐他汀。膽固醇是高血壓的重要原因，膽固醇生成的一個(gè)限速性步驟是1，329

1987年，Merck公司的降血脂藥物洛伐他訂（lovastatin，Mevacor）獲FDA批準(zhǔn)上市后，立即引起了醫(yī)學(xué)界的關(guān)注，該藥的成功開創(chuàng)了降血脂藥物的嶄新階段。其后，先后又有辛伐他?。╯imvastatin，Zocor）、普伐他?。≒ravastatin,Mevalotin）、氟伐他?。╢luvastatin,Lescol）上市。第5個(gè)上市的是輝瑞公司的阿托伐他?。╝torvastatinCa，Lipitor），后者為他汀類藥物中唯一能明顯降低高膽固醇血癥病人升高的低密度脂蛋白膽固醇及甘油三酯的藥物。第6個(gè)上市的是拜耳公司的西立伐他?。╟erivatatin，Lipobay），但該藥因不良反應(yīng)于2001年8月撤下。盡管如此，他汀家庭依然人丁興旺，在降血脂藥物中占據(jù)極為重要的一席。1987年，Merck公司的降血脂藥物洛伐他訂（lov30食物中的淀粉經(jīng)口腔唾液、胰淀粉酶消化成低聚糖（或稱寡糖）以及雙糖與三糖，進(jìn)入小腸經(jīng)α-葡萄糖苷酶作用下分解為單個(gè)葡萄糖，為小腸吸收。在生理狀態(tài)下，小腸上，中、下三段均存在α-葡萄糖苷酶，在服用α-葡萄糖苷酶抑制劑后上段可被抑制,而糖的吸收僅在中、下段，故吸收面積減少，吸收時(shí)間后延，從而對降低餐后高血糖有益,在長期使用后亦可降低空腹血糖。

食物中的淀粉經(jīng)口腔唾液、胰淀粉酶消化成低聚糖（或稱寡糖）以及31微生物菌體制品利用微生物制作的保健品，含有活的菌體，如昂立1號(hào)、麗珠腸樂、整腸生等，也有以死菌體的制品，如冬蟲夏草、靈芝孢子等，其中也存在微生物的部分代謝產(chǎn)物。微生物菌體制品利用微生物制作的保健品，含有活的菌體，如昂立132免疫調(diào)節(jié)劑烏苯美司（激活人體細(xì)胞免疫功能，刺激細(xì)胞因子的生成和分泌，促進(jìn)抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞的產(chǎn)生和增殖）環(huán)胞菌素A（免疫排斥作用，抑制T淋巴細(xì)胞增殖、分化等，影響淋巴細(xì)胞的功能，）。藤霉素（FK506）雷泊霉素（免疫抑制劑）對器官移植、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎硬變綜合征和牛皮癬、紅斑狼瘡等無特效藥可冶的免疫病有效。

免疫調(diào)節(jié)劑33受體拮抗劑受體是細(xì)胞中一類生物活性分子，其功能是特異性地識(shí)別和結(jié)合化學(xué)信使，如藥物激素、神經(jīng)遞質(zhì)等配基，然后在體內(nèi)放大其反應(yīng)，是體內(nèi)信息傳遞的重要途徑。根據(jù)對受體配基結(jié)合的拮抗作用，可以篩選出特異性強(qiáng)、毒性小的具有藥理作用的藥物。受體拮抗劑34 擔(dān)子菌類真菌，如靈芝、香菇、黑木耳、白木耳、茯苓、冬蟲夏草等等食用菌和藥用菌，有許多有效的醫(yī)療價(jià)值。 真菌多糖對于人體具有免疫調(diào)節(jié)和激活淋巴細(xì)胞的功能，可作為免疫增強(qiáng)劑，從而可以提高人體抵御各種感染和抗腫瘤等方面的能力。香菇多糖(lentinan)就是一個(gè)典型的T細(xì)胞激活劑。冬蟲夏草多糖(CP)、蜜環(huán)菌多糖AP、樹舌靈芝多糖(G-Z)、銀耳多糖(TP)、猴頭多糖(HEPS)、塊菌多糖(PST)、裂褶菌多糖(SPG)等都能在體外顯著增強(qiáng)半刀豆球蛋白A(ConA)誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖。

擔(dān)子菌類真菌，如靈芝、香菇、黑木耳、白木耳、茯苓、冬蟲夏草35微生物免疫制劑1、人工自動(dòng)免疫制劑 是專用于免疫預(yù)防的制劑，主要指各種疫苗。目前已知的疫苗可分為活苗，死苗，代謝產(chǎn)物和亞單位疫苗以及生物技術(shù)疫苗等。2、人工被動(dòng)免疫制劑將免疫血清或自然發(fā)病康復(fù)后的動(dòng)物血清人工輸入未免疫的動(dòng)物，使其獲得對某種病原的抵抗力，這種免疫接種方法成為人工被動(dòng)免疫。人工被動(dòng)免疫制劑是專用于免疫治療的免疫制劑，可分為特異性與非特異性免疫治療劑兩大類。微生物免疫制劑1、人工自動(dòng)免疫制劑36微生物毒素的藥物應(yīng)用細(xì)菌毒素有葡萄球菌毒素、鏈球菌外毒素、肉毒毒素、霍亂弧菌毒素、志賀氏菌毒素、白喉?xiàng)U菌毒素、炭疽桿菌毒素、梭菌毒素等等。真菌毒素有黃曲霉毒素、麥角、雜色曲霉素、煙曲霉震顫素、玉米赤霉烯酮、毒蘑菇毒素等等。微生物毒素的藥物應(yīng)用37（事物的兩面性）尋找新藥的資源庫。（1）可直接用作藥物，如肉毒毒素可用于治療重癥肌無力和功能性失明的眼瞼及內(nèi)斜視。利用白喉毒素的A鏈與多種癌癥細(xì)胞抗體連接研制出導(dǎo)向抗癌藥物。（2）以微生物毒素為模板，改造和設(shè)計(jì)抗病抗癌和治療新藥。（3）作為外毒素菌苗使用，如肉毒毒素、白喉類毒素、炭疽毒素、金黃色葡萄球菌毒素、破傷風(fēng)毒素，等。（4）作為超抗原（SAg）使用，是多克隆有絲分裂原，激活淋巴細(xì)胞增殖的能力遠(yuǎn)比植物凝集素高10~100倍，可用于治療自身免疫性疾病。（5）從毒蘑菇毒素中尋找抗癌新藥。（事物的兩面性）尋找新藥的資源庫。38血管緊張素Ⅱ與其受體結(jié)合后的復(fù)合物，會(huì)引起高血壓。已篩選到的血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑Losartar有降血壓作用，已上市。從曲霉分離到的Asperlicin是縮膽囊素受體拮抗劑，它是肽類激素，對胰液和胃液的分泌、膽囊收縮及腸道運(yùn)動(dòng)有調(diào)節(jié)作用，有可能作為治療與縮膽囊素有關(guān)的胃腸系統(tǒng)疾病。從鏈霉菌分離到的六肽類催產(chǎn)素受體拮抗劑，有可能用于延緩早產(chǎn)。目前研究的還有內(nèi)皮素受體拮抗劑、腎上腺受體拮抗劑、白三烯受體拮抗劑以及艾滋病的CD4／gp120結(jié)合拮抗劑。

血管緊張素Ⅱ與其受體結(jié)合后的復(fù)合物，會(huì)引起高血壓。已篩選到的39第二十一章

藥物制劑的微生物學(xué)檢查滅菌制劑的無菌檢查非滅菌制劑的微生物限度檢查第二十一章

藥物制劑的微生物學(xué)檢查滅菌制劑的無菌檢查40注射劑眼科制劑手術(shù)用品（敷料、縫合線、無菌器具等）滅菌制劑滅菌制劑41一般藥品的無菌檢查

—直接接種法需氧菌、厭氧菌、霉菌的檢查需氧菌：30~35℃，7天厭氧菌：30~35℃，7天霉菌：20~25℃，7天觀察培養(yǎng)液是否混濁或涂片染色鏡檢一般藥品的無菌檢查

—直接接種法需氧菌、厭氧菌、霉菌的檢查42

陽性對照—（24h有菌生長）金黃色葡萄球菌